Normalized Mate & Plate™ ライブラリー（酵母導入済み）

Normalized Mate & Plate Libraryは、均一化処理が行われた酵母Y187株（接合型 MATα）形質転換済みのツーハイブリッド解析用cDNAライブラリーである。本ライブラリーはDSN（duplex-specific nuclease）を用いた均一化処理により、発現量の多い転写産物の割合を選択的に低下させている（図1）。これによりサンプル中の転写産物の存在量が均一になるため、偽陽性クローンの出現が抑えられ、発現量が低い目的遺伝子のスクリーニングをより短時間で行うことが可能である（1）。また、酵母への形質転換が完了しているため、面倒な大腸菌でのライブラリー増幅やラージスケールでのプラスミド回収の必要がなく、接合によるツーハイブリッドスクリーニングをより簡便に行うことができる（図2）。
Normalized Mate & Plate Universal Library（ヒトまたはマウス由来）は、広範な遺伝子発現を示すことを確認した各種組織から調製したRNAプールを出発材料に用いてcDNA合成を行い、さらに均一化処理を行っている。このため広範な遺伝子クローンをカバーしており、目的のタンパク質と相互作用を示す真の陽性クローンをより確実にスクリーニングすることができる（3）。

これらすべての均一化処理済みライブラリーは、均一化効率をロットごとに厳密に確認した後、preyベクターpGADT7-RecABへクローニングされている（図3）。Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System（製品コード 630489）とNormalized Mate & Plateライブラリーシリーズを用いることで、ツーハイブリッドスクリーニングが非常に効率よく実施可能である。また、Matchmaker Two-Hybrid System 3（販売終了）のAH109株を用いたツーハイブリッドスクリーニングにも使用できる。


図1. 各遺伝子のcDNA量の均一化
均一化処理前後のUniversal cDNA（ヒト混合組織から作製）について、NimbleGen Homo sapiensマイクロアレイを用いて各遺伝子から得られるシグナル強度を解析した。均一化処理により、発現量の多い約3,300の遺伝子の存在量が大きく減少していることが分かる。


図2. "Mate & Plate"プロトコールによる接合スクリーニング
既知のタンパク質を発現するbaitベクターで形質転換済の酵母Y2HGold株と、Mate & Plateライブラリーを混合して一晩培養し接合を行う。培養後、選択培地に蒔いて相互作用を示す陽性クローンを選択する。

図3. DSN均一化処理により高発現転写産物の存在量を抑制
均一化処理前後のHuman Universal cDNA（PCR産物）サンプル中に存在する、β-ActinまたはGAPDHの存在量をバーチャルノーザンブロット解析を用いて比較した。それぞれのcDNAサンプルは1.5%アガロースゲルで電気泳動し、Hybond-Nメンブレンに転写した。PCR増幅したβ-ActinおよびGAPDHのプローブを³²P-dATPで標識し、メンブレン上でハイブリダイズさせた。非均一化処理サンプル中の各遺伝子には強いバンドが現れたが、均一化サンプル中では出現せず、発現量の多い転写産物量が均一化処理後に大きく減少したことが分かる。
レーンC：非均一化処理サンプル　レーンN：均一化処理サンプル

・Library culture in S. cerevisiae Y187　1 ml×5 or 2
（ライブラリーはpGADT7-RecABベクターにクローニングされています。）
・pGADT7-T Vector in S. cerevisiae Y187

－70℃