CycleavePCR™ O-157(VT1/VT2) Typing Kit

本キットは、O157：H7をはじめとするEHECによる食中毒の原因遺伝子であるベロ毒素遺伝子VT1、VT2 をリアルタイムPCR装置を用いて検出およびタイピングするためのキットである。本キットの増幅にはホットスタートPCR用酵素、TaKaRa Ex Taq Hot Start Versionを使用しており、反応液調製時などサイクル前のミスプライミングやプライマーダイマーに由来する非特異的増幅を防ぐことができ、高感度の検出が可能になる。増幅産物の検出にはサイクリングプローブ法を採用している。サイクリングプローブ法は、RNAとDNAからなるキメラプローブと RNase Hの組み合わせによる高感度な検出方法で、増幅中や増幅後の遺伝子断片の特定配列を効率良く検出することができる。プローブは片方の端が蛍光物質で、もう片方の端がその蛍光物質の発する蛍光を消光する物質（クエンチャー）で標識されている。このプローブは、インタクトな状態ではクエンチングにより蛍光を発することはないが、配列が相補的な増幅産物とハイブリッドを形成した後に RNase HによりRNA部分で切断されることにより、強い蛍光を発するようになる。
この蛍光強度を測定することで、増幅産物量をモニターすることができる。本キットには、VT1遺伝子およびVT2遺伝子を検出するための2種類のFAM標識プローブと、インターナルコントロールDNAとインターナルコントロール検出用のROX標識プローブが含まれている。二波長を同時にモニタリングすることで、一本のチューブでVT1 遺伝子またはVT2遺伝子の検出と、インターナルコントロールDNAの検出による偽陰性のモニターが可能である。リアルタイム検出なので、電気泳動が不要であり、迅速に結果が得られる。
また、本キットでは各コンポーネントのプレミックス化、ならびに検体調製（アルカリ熱抽出）に必要な試薬類の添付により、検出操作の簡便化を図っている。
なお、本キットではVT1遺伝子とVT2遺伝子をタイピングするために1サンプルに対してVT1検出系とVT2検出系の反応液を別に調製してリアルタイムPCRを行う。VT1、VT2遺伝子検出用Primer/Probe Mixを混合して使用することはできない。VT1遺伝子とVT2遺伝子をタイピングをする必要がない場合は、CycleavePCR O-157（VT gene）Screenig Kit Ver. 2.0（製品コード CY217）をご使用ください。

（25 μl反応、VT1, VT2各25回）

	1.	2×Cycleave Reaction Mixture	625 μl
	2A.	VT1 Primer/Probe Mix（FAM, ROX）* (5×conc.)	125 μl
	2B.	VT2 Primer/Probe Mix（FAM, ROX）* (5×conc.)	125 μl
	3.	dH2O	1 ml
	4.	NaOH Solution (50 mM)	1.5 ml×4
○	5.	Tris-HCl Buffer pH7.0 (1 M)	0.5 ml×2
	6.	dH2O（for Dilution)	1 ml
	7.	VT1 Positive Control	100 μl（20回分）
	8.	VT2 Positive Control	100 μl（20回分）

* プライマーは株式会社島津製作所で製造されたものである。蛍光標識プローブを含んでるので、遮光に留意すること。本プライマーでは、ベロ毒素1型（VT1）および2型（VT2、VT2vha、VT2vhb、VT2vp1）遺伝子を検出する。
本プライマーでは、ベロ毒素1型（VT1）および2型（VT2、VT2vha、VT2vhb、VT2vp1）遺伝子を検出します。ターゲット遺伝子の増幅サイズは171 bpです。

－20℃
開封後は、コンポーネント1～3 および4～8を別々の箱に入れ、それぞれ－20℃で保存する。

【機器】

・リアルタイムPCR装置^* および専用チューブ

　Thermal Cycler Dice Real Time System II（製品コード TP900/TP960：終売）
　Thermal Cycler Dice Real Time System Lite（製品コード TP700/TP760）
　　　食品環境検査用ソフトウェア（日本語表示）
　　　または、Thermal Cycler Dice Real Time System Software
　Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System（Thermo Fisher Scientific社）
　（詳しくは弊社までお問い合わせください。）

・ヒートブロック（95℃まで温度を上げられるもの）

・卓上遠心機

・微量高速遠心機（4℃設定可能）

【その他】

200 μl、20 μl、10 μl各マイクロピペット

マイクロピペット用チップ（疎水性フィルター付）

* 本製品はSmart Cycler II Systemではご使用できません。

Thermal Cycler Dice Real Time Systemシリーズ「食品環境検査用ソフトウェア」を使用の場合に便利な“Quick Manual”を用意している。
キットに添付の取扱説明書とあわせて使用する。

CycleavePCRキットによる定性解析（PDF、989 K）