Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2

Exo-free Klenow Type
製品コード メーカー
略称
製品名 容量 価格(税別) 特記事項 説明書、CoA
データシート
ベクター情報
参考資料 カート
Takara Code
6045

TKR

タカラバイオ(株)
Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2
30回 ¥33,000
説明書・データシート・ベクター情報
6045
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製品説明

[α-32P]、[3H]dCTPを用いてDNAをラベルし、ハイブリダイゼーション用のDNAプローブを作製するためのキットである。FeinbergとVogelsteinの方法に改良を加えたもので、簡単な操作で高比放射活性のDNAプローブが作製できる。さらに、Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2では、3'→5'exonuclease活性を除去したExo-free Klenow Fragmentと9 merのRandom Primerを組み合わせることで、1×109 dpm/μgの高比活性プローブを短時間(10分以内)で得ることを可能とした。

内容

(30回分)
1. Random Primer(9 mer)60 μl
2. 10×Buffer75 μl
3. dNTP Mixture75 μl
4. Exo-free Klenow Fragment(2 U/μl)30 μl
5. Control DNA(λ-Hind III Fragment 25 ng/μl)10 μl

保存

-20℃

注意

  • 本製品は反応にrandom primerを用いているため、300 bp以下の鋳型DNAを使用すると取り込み率が低下したり、十分な長さのプローブが得られない場合があります。鎖長の短い(特に150 bp以下)鋳型DNAを使用する場合は、MEGALABEL(製品コード 6070)を用いた末端標識をお勧めします。
  • GC含量が高い鋳型DNAあるいは高次構造をとりやすい鋳型DNAを使用すると、高次構造の影響で取り込み率が低下することがあります。そのような場合は、高温で反応できるBcaBEST Labeling Kit(製品コード 6046)の使用をお勧めします。
図1 Random Primer DNA Labeling Kit Ver. 2でのプローブの比活性と反応時間
テンプレートとしてλ-Hind III 断片25 ngを使用

ランダムプライマーDNAラベリング法について

ハイブリダイゼーション法によりDNA中に存在する特異的配列を検出する際には、非常に高い比放射活性を持つDNAプローブが必要である。
このDNAプローブ作製のために用いられるDNA標識法としては、従来はニックトランスレーション法が主に用いられていたが、このニックトランスレーション法には、次のような欠点があることが知られている。
1.放射性物質の取り込み率が比較的低い。
2.長時間の反応を行うと、DNA Polymerase I のexonuclease活性によりすでに取り込まれた放射性物質が遊離し、取り込み率が低下する。
3.鋳型となるDNAが高純度であることが必要である。
4.反応後に未反応の放射性dNTPを除去する必要がある。
1983年にFeinberg, A. P. とVogelstein, B. により発表されたランダムプライマーとKlenow Fragmentを用いてDNAの標識を行う方法は、これらの欠点を持たないDNA標識法である(表1)。その原理を図2に示した。鋳型DNAを熱変性により一本鎖DNAとし、この一本鎖DNAに対しランダムプライマーをアニールさせた後、Klenow Fragmentを用いて相補鎖合成を行う。このとき、dNTPの一つあるいは複数に〔α-32P〕〔α-35S〕〔3H〕等の標識化合物を用いると、合成される相補鎖が標識される。この相補鎖を熱変性により一本鎖とし、ハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。

表1 DNA標識法の比較

ニックトランスレーション法 ランダムプライマーDNAラベリング法
反応時間
および
反応モニター
長時間の反応により取り込み率が低下する。このため反応モニターを行い、取り込み率を測定する必要があ る。 短時間で高非活性プローブが得られる。また、長時間の反応を行っても取り込み率は低下しない。
プローブの比活性 ~108 dpm/μg ~109 dpm/μg
鋳型DNA中の不純物の影響 アガロース等の混入によって反応が阻害される。 アガロース等の混入によってほとんど阻害されない。
鋳型DNA量 1 μg程度 25 ng
反応後の処理 ゲルろ過による未反応dNTPの除去が必要。 反応液から未反応dNTPの除去をすることなくハイブリダイゼーションに用いることができる。


図2 ランダムプライマーによるDNA標識の原理
注意事項
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