Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2

Standard Protocol
 (Random Primer DNA Labeling Kit, BcaBEST Labeling Kit)

操作手順

1.マイクロチューブ(エッペンドルフ型、ポリプロピレン製)に下記の反応液*2を調製する。95℃で3分間加熱した後、氷中で急冷し5分間放置する。
鋳型DNA*125 ng
Random Primer2 μl
滅菌精製水(またはTE Buffer) 5 μlにfill up *2

2.10×Buffer、dNTP Mixtureを各2.5 μl、標識dCTP*3(50 μCi)を5 μl加えて、滅菌精製水で24 μlにfill upする。
〈Random Primer DNA Labeling Kit Ver. 2の場合〉
3.Exo-free Klenow Fragment 1 μlを加え、37℃で10分間*4保温する。

4.65℃で5分間加熱し、酵素を失活させる(またはEDTAを最終濃度が30 mMになるように加える)。

BcaBEST Labeling Kitの場合〉
3.BcaBEST DNA Polymerase 1 μlを加え、50~55℃で10分間*4保温する。

4.EDTAを最終濃度が30 mMになるように加える。

5.95℃で3分間加熱した後、氷中で急冷する。

6.そのまま適量をハイブリダイゼーションプローブ液として用いる必要ならば(NucleoSpin Gel and PCR Clean-up(製品コード 740609.10/.50/.250)、ゲルろ過あるいはエタノール沈殿で未反応の標識dCTPを除去する)。

*1 このキットは、鋳型DNAを25 ng用いることを標準としているが、10 ng~1 μgの範囲ではこの手順にしたがって反応が行える。
また、アガロースを除かずに低融点アガロースゲル中のDNAを反応に使用することも可能である(このとき、アガロースにはPrimeGel Agarose LMT 1-20K GAT(製品コード 5806A)PrimeGel Agarose LMT PCR-Sieve GAT(製品コード 5815A)が適している)。
手順は次の通りである。
(1)アガロースゲル電気泳動を行い、目的とする断片を含むアガロースゲル片を切り出す。
(2)ゲル片の重量の3倍量の滅菌精製水を加える。
(3)65℃でアガロースを溶解させる。
(4)DNA25 ng分の溶液を、そのまま鋳型DNAとして反応に用いる。
*2鋳型DNAの溶液濃度が低い場合には、14 μlまでscale upできる。その場合は、TE Bufferでfill upする。
*3このキットは、〔α-32P〕dCTP(111 TBq/mmol、3,000 Ci/mmol)を用いて標識するように組み立てられているが、〔α-35S〕または〔3H〕標識のdCTPも同様に使用できる。
比活性の異なる標識のdCTPを使用する場合は、反応液中の濃度が変化しないように標識dCTPの量を調節する。
また、放射性dATPを用いて標識を行うときには、dNTP MixtureとしてdGTP、dCTP、dTTP各0.2 mMの溶液を用いる。
*4 反応時間は、10分間で充分高い比活性を持つプローブが得られる。またオーバーナイト反応においても、取り込み率の低下はごくわずかである。

Protocol
取り込み率・比活性の測定
1.反応液の少量をTE Bufferまたは滅菌精製水で20倍に希釈する。
2.希釈した反応液3 μlをDE81 paper disc(Whatman社製)2枚にスポットして、風乾する。
3.2. のDE81 discのうちの1枚を、5%Na2HPO4 100 ml程度で5分間ずつ6回、さらに滅菌精製水で1分間ずつ2回、エタノールで2回洗浄し風乾する。
4.2. の未洗浄のDE81 discと3で洗浄したDE81 discのそれぞれを、液体シンチレーションカウンターで測定する。
5.次の式により、取り込み率、プローブの比活性を求める。

取り込み率


Note
鋳型DNA量の変化によるプローブ比活性の変動
1.Random Primer DNA Labeling Kit Ver. 2
鋳型DNA量    (ng)10 25100 1,000
プローブの比活性 (dpm/μg)3.0×109 1.9×1090.68×109 0.77×108

2.BcaBEST Labeling Kit

鋳型DNA量    (ng)10 25100 1,000
プローブの比活性 (dpm/μg)2.9×109 1.9×1090.68×109 0.78×108
λ-Hind III 断片を〔α-32P〕dCTP(111 TBq/mmol、3,000 Ci/mmol)1.85 MBq(50 μCi)を用いてラベルした場合

  Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2