Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2

［α-³²P］、［³H］dCTPを用いてDNAをラベルし、ハイブリダイゼーション用のDNAプローブを作製するためのキットである。FeinbergとVogelsteinの方法に改良を加えたもので、簡単な操作で高比放射活性のDNAプローブが作製できる。さらに、Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2では、3'→5'exonuclease活性を除去したExo-free Klenow Fragmentと9 merのRandom Primerを組み合わせることで、1×10⁹ dpm/μgの高比活性プローブを短時間（10分以内）で得ることを可能とした。

（30回分）

1.	Random Primer（9 mer）	60 μl
2.	10×Buffer	75 μl
3.	dNTP Mixture	75 μl
4.	Exo-free Klenow Fragment（2 U/μl）	30 μl
5.	Control DNA（λ-Hind III Fragment 25 ng/μl）	10 μl

－20℃

図1 Random Primer DNA Labeling Kit Ver. 2でのプローブの比活性と反応時間
テンプレートとしてλ-Hind III 断片25 ngを使用

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ランダムプライマーDNAラベリング法について

ハイブリダイゼーション法によりDNA中に存在する特異的配列を検出する際には、非常に高い比放射活性を持つDNAプローブが必要である。
このDNAプローブ作製のために用いられるDNA標識法としては、従来はニックトランスレーション法が主に用いられていたが、このニックトランスレーション法には、次のような欠点があることが知られている。
1．放射性物質の取り込み率が比較的低い。
2．長時間の反応を行うと、DNA Polymerase I のexonuclease活性によりすでに取り込まれた放射性物質が遊離し、取り込み率が低下する。
3．鋳型となるDNAが高純度であることが必要である。
4．反応後に未反応の放射性dNTPを除去する必要がある。
1983年にFeinberg, A. P. とVogelstein, B. により発表されたランダムプライマーとKlenow Fragmentを用いてDNAの標識を行う方法は、これらの欠点を持たないDNA標識法である（表1）。その原理を図2に示した。鋳型DNAを熱変性により一本鎖DNAとし、この一本鎖DNAに対しランダムプライマーをアニールさせた後、Klenow Fragmentを用いて相補鎖合成を行う。このとき、dNTPの一つあるいは複数に〔α-³²P〕〔α-³⁵S〕〔³H〕等の標識化合物を用いると、合成される相補鎖が標識される。この相補鎖を熱変性により一本鎖とし、ハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。

表1　DNA標識法の比較

	ニックトランスレーション法	ランダムプライマーDNAラベリング法
反応時間 および 反応モニター	長時間の反応により取り込み率が低下する。このため反応モニターを行い、取り込み率を測定する必要があ る。	短時間で高非活性プローブが得られる。また、長時間の反応を行っても取り込み率は低下しない。
プローブの比活性	～108 dpm/μg	～109 dpm/μg
鋳型DNA中の不純物の影響	アガロース等の混入によって反応が阻害される。	アガロース等の混入によってほとんど阻害されない。
鋳型DNA量	1 μg程度	25 ng
反応後の処理	ゲルろ過による未反応dNTPの除去が必要。	反応液から未反応dNTPの除去をすることなくハイブリダイゼーションに用いることができる。

図2　ランダムプライマーによるDNA標識の原理