SMART-Seq^® mRNA Single Cell / SMART-Seq^® mRNA Single Cell LP

SMART-Seq mRNA Single Cellキット（SSmRNA Single Cell）は、シングルセルや核からのRNA-Seqに適した高感度で再現性の高いcDNA合成キットです。RNA含有量が少ないことが知られている末梢血単核細胞（PBMC）、T細胞、B細胞などのシングルセルから直接、Oligo（dT）プライマーを用いて高品質な完全長cDNAの合成が可能です。
SMART-Seq mRNA Single Cell LPキット（SSmRNA Single Cell LP）は、cDNA合成のためのSSmRNA Single Cellと、酵素による断片化およびステムループアダプターを組み込んだライブラリー調製キットが含まれており、イルミナ社次世代シーケンサー対応の高品質なライブラリー調製が可能です。またUnique Dual Index Kit（別売り）と組み合わせることで、最大384サンプルのマルチプレックス解析に対応できます。断片化とアダプター付加の2ステップワークフローは、途中で精製工程が不要なため1チューブで完結でき、コンタミやサンプルロスを軽減し、約2時間でステップが完了します。これにより高収量なライブラリーが得られ、ハイスループットシーケンサーへの対応や再現性の高い解析が可能となります。
無料のバイオインフォマティクス解析ツールCogent NGSもご用意しており、サンプルからのcDNA合成、ライブラリー調製、データ解析までend-to-endのソリューションを提供いたします。

Cogent NGSソフトウェアは下記ページからダウンロードしてください。
Cogent NGS Discovery Software（TB USA社）
Cogent NGS Analysis Pipeline（TB USA社）

FORMULATRIX社の試薬自動分注装置MANTIS Microfluidic Liquid Handlerを用いた、96ウェルプレートでのcDNA合成プロトコールはこちら
Full-volume（TB USA社）
Quarter-volume（TB USA社）

※	以下のデータは、SSmRNA Single Cell / Single Cell LPと同じケミストリー・性能のSMART-Seq Single Cellキット（SSsc）（製品コード 634470/634471/634472）とSMART-Seq Single Cell PLUSキット（SSsc PLUS）（製品コード R400750/R400751）で得たものを示しています。

図1. SMART-Seq2法との比較
リンパ芽球様細胞株GM12878のシングルセルからSMART-Seq Single Cell Kit（SSsc；18サンプル）および SMART-Seq2 法（SMART-Seq2；20サンプル）によってcDNAを合成し（各19サイクルで増幅）、RNA-Seqライブラリーを調製してシーケンス解析を行った。全てのサンプルは175万ペアエンドリードにノーマライズした。

パネルA：	cDNAの合成方法によってマッピング結果が異なっており、SMART-Seq2ではミトコンドリアゲノムへのマッピング率が多く、遺伝子同定に使用できるリード数が少なかった。
パネルB：	SMART-Seq Single Cell Kitでは、SMART-Seq2に比べて多くの遺伝子が検出された。

図2. SMART-Seq v4との比較

パネルA：	リンパ芽球様細胞株GM22601の12個のシングルセルからSMART-Seq Single Cell Kit（SSsc）、またはSMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencing（SSv4）（製品コード 634888など）を用いてcDNAを合成した（各19サイクルで増幅）。cDNAの収量は、SMART-Seq Single Cell Kitの方が大幅に多い結果となった。
パネルB：	シングルドナーから採取したPBMC約50個のシングルセルからSMART-Seq Single Cell Kit、またはSMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for SequencingでcDNAを合成し、RNA-Seqライブラリーを調製してシーケンス解析を行った。解析に使用したリード数に関係なく、SMART-Seq Single Cell KitではSMART-Seq v4の1.6倍以上の遺伝子が検出された。 SMART-Seqテクノロジーをシングルセル解析用に改良したSMART-Seq Single Cell Kitの優れた感度が示された。

図3. SMART-Seq Singl Cell PLUS KitとNextera XTとの比較

パネルA：	SMART-Seq Single Cell Kitを使用して10 pgのマウス脳total RNAから3連でcDNAを合成した。次に、SMART-Seq Single Cell PLUS Kitに含まれるSMART-Seq Library Prep KitまたはNextera XT Kitを使用して、イルミナ社シーケンサー用のライブラリーを調製した。ライブラリーを4M paired-end リードにノーマライズし、NextSeq500でシーケンスを行った。
パネルB：	SMART-Seq Single Cell PLUS Kitは、Nextera XTより高収量のライブラリーが得られた。
パネルC：	SMART-Seq Single Cell PLUS Kitは、Nextera XTと比較してより多くの遺伝子が同定できた。

図4. Mosquito HVを用いたcDNA合成の自動化と小型化対応
CHO細胞のシングルセルから、mosquito HVを用いて全量（FV）、1/8量（Eighth）のライブラリーを調製し、遺伝子カウント数を比較した（中央値：FV=16,592、Eighth=16,014）。この結果から、小ボリュームのインプットでも全量インプットと変わらない感度でライブラリー調製をできることが示された。

図5. MANTIS liquid handlerを用いたcDNA合成の自動化と小型化対応
GM12878細胞のシングルセルから、FORMULATIX社のMANTIS liquid handlerを用いて全量（FV）、1/4量（Quarter）のライブラリーを作製し、遺伝子カウント数を比較した（中央値：FV=9,980、Eighth=9,603）。この結果から、小ボリュームのインプットでも全量インプットと変わらない感度でライブラリー調製をできることが示された。



図6. 他社ライブラリー調製キットとの識別性の比較
UMAPクラスタリング解析では、ネガティブコントロールとポジティブコントロール／シングルセルサンプルが明確に分かれてクラスタリングされた。SSsc PLUSでライブラリー調製したサンプルは、ポジティブコントロール（●）とシングルセルサンプル（●）はまとまってクラスタリングされ、ネガティブコントロール（●）はグラフ下方にクラスタリングされた。一方、N社のライブラリー調製キットで調製した全サンプル（●ネガティブ、●ポジティブ、●シングルセルサンプル）は、SSsc PLUSで調製したネガティブコントロール（●）付近にクラスタリングされた。 このことから、SSsc PLUSは他社キットよりも高い識別性を有し、スタートサンプルが少量の場合でも実験ノイズが結果の信頼性へ影響を与えないことが示された。

図7. SMART-Seq2法、SMART-Seq3法との性能比較
GM12878細胞を用いてSMART-Seq Single Cell KitとSMART-Seq2（SS2）法を、PBMCから単離した初代T細胞を用いてSMART-Seq Single Cell PLUS KitとSMART-Seq3（SS3）法を比較した。
SMART-Seq Single Cell Kit は、SMART-Seq2（SS2）法よりも多くの遺伝子数を検出できた。


図8. SMART-Seq Library Prep KitとNextera XT kits（イルミナ社）との比較
SSsc PLUSおよびNextera XTを用いて同一のcDNAからライブラリーを2つずつ調製し、全遺伝子のTPM値をプロットして散布図を作成した（上図左、中央）。さらにSSsc PLUSとNextera XTで調製したライブラリー同士も比較した（上図右）。各散布図のR²値はグラフに示してある通り（Nextera XT R²値=0.9961、SSsc PLUS R²値=0.9978、Nextera XT vs SSsc PLUS R²値=0.9579）。

SMART-Seq mRNA Single Cell（製品コード 634789/634790/634785）

Box 1（Store at －70℃）

Control Total RNA（1 µg/µl）（マウス脳由来）

Box 2（Store at －20℃）

10× Lysis Buffer
RNase Inhibitor（40 U/μl）
Nuclease-Free Water
SMART-Seq sc TSO
3′SMART-Seq CDS Primer II A
SMARTScribe II Reverse Transcriptase
SMART-Seq sc First Strand Buffer （5×）
SeqAmp DNA Polymerase
SeqAmp CB PCR Buffer（2×）
PCR Primer
Elution Buffer（10 mM Tris-Cl, pH8.5）

SMART-Seq mRNA Single Cell LP（製品コード 634786/634787/634788）

SMART-Seq mRNA Single Cell（製品コード 634789/634790/634785）

SMART-Seq Library Prep Kit^＊

10× FE
FE Dilution Buffer
Lib Prep Buffer
Lib Prep Enzyme
Rxn Enhancer
Stem Loop Adapters
Amplification Buffer
PrimeSTAR HS DNA Polymerase（5 U/μl）
Nuclease-Free Water

^＊Library Prep Kitの単品販売はありません。

SMART-Seq mRNA Single Cell

• Control Total RNA：－70℃
• その他のコンポーネント：－20℃
• （10× Lysis Buffer：融解後は4℃保存、Elution Buffer：融解後は室温保存）

SMART-Seq Library Prep Kit：－20℃

下記の製品は本キット中に含まれません。下記の製品はユーザーマニュアルに記載のProtocolで使用できることが確認されています。

Index Kit

• Unique Dual Index Kit (1-24)（製品コード 634756）
  UDI No. U001-U024
• Unique Dual Index Kit (1-96)（製品コード 634752）
  UDI No, U001-U096
• Unique Dual Index Kit (97-192)（製品コード 634753）
  UDI No, U097-U192
• Unique Dual Index Kit (193-288)（製品コード 634754）
  UDI No, U193-U288
• Unique Dual Index Kit (289-384)（製品コード 634755）
  UDI No, U289-U384

セルソーティング

• 8-tube strips（Thermo Fisher Scientific社 Cat. No. AB0264）またはセルソーティングに適したPCR tube strips, 96 well plates
• （オプション）BD FACS Pre-Sort Buffer（BD社 Cat. No. 563503）
• Low-speedの96 well plate/strip用卓上遠心機
• Adhesive PCR Plate Foils（Thermo Fisher Scientific社 Cat. No. AB-0626）またはFlat PCR Caps, strips of 8（Thermo Fisher Scientific社 Cat. No. AB0784/AB0850）
• ドライアイス（細胞の凍結用）
• （オプション）SMART-Seq HT Kit Lysis Components（製品コード 634439）または10× Lysis Buffer（製品コード 635013）

PCR増幅およびバリデーション

• First-Strand cDNA 合成専用のPCRサーマルサイクラー
• Double-Strand cDNA 増幅専用のPCRサーマルサイクラー
• 96 well Plate用粘着シール：Thermo Scientific Adhesive PCR Plate Seals（Thermo Fisher Scientific社 Cat. No. AB0558）または 8 tube strips用Cap strips（Thermo Fisher Scientific社 Cat. No. AB0784/AB0850）

SPRI Bead精製

• NucleoMag NGS Clean-up and Size Select（5 ml size：製品コード 744970.5；50 ml size：製品コード 744970.50；500 ml size：製品コード 744970.500）
  ※NucleoMagの代わりにAMPure XP PCR purification kit（Beckman Coulter社 5 ml size：Cat. No. A63880；60 ml size：Cat. No. A63881）も使用可能
• Magnetic Separation Device
12～24サンプル用

0.2 mlチューブ：SMARTer-Seq Magnetic Separator - PCR Strip（製品コード 635011）など
0.2 mlチューブまたはストリップ用遠心機

24～96サンプル用

96 well フォーマット用：Magnetic Stand 96（Thermo Fisher Scientific社 Cat. No. AM10027）など

1.5 ml用（シーケンス用ライブラリーをプールする場合に必要）

Magnetic Stand（製品コード 631964）
8 tube strips（Thermo Fisher Scientific社 Cat. No. AB0264）またはPCRラックに固定されNuclease-freeのPCR tube strips、またはセルソーターで動作確認済みの96 well Plate

• 80％ Ethanol（必ず用時調製すること）

ライブラリー調製

• Nuclease-free, PCR grade, thin-wall PCR strips（0.2 ml PCR 8 tube strip; Thermo Fisher Scientific社 Cat. No. AB0264）
• Nuclease-free low-adhesion 1.5 ml tubes（USA Scientific社 Cat No. 1415-2600）または、DNA LoBind tubes（Eppendorf社 Cat. No. 022431021)
• Benchtop cooler, VWR CryoCoolers（VWR社 Cat. No. 414004-286）など

その他

• シングルチャンネルピペット：10 μl、20 μl、200 μlおよび1,000 μl
• 8連チャンネルピペット：20 μl、200 μl
• フィルターピペットチップ：10 μl、20 μl、200 μlおよび1,000 μl
• 1.5 mlチューブ用微量遠心機
• 0.2 mlチューブまたはstrip用微量遠心機
• 96 well冷却ラック：IsoFreeze PCR Rack（MIDSCI社 Cat. No. 5640-T4）または96-Well Aluminum Block（Light Labs社 Cat. No. A-7079）など