SMART-Seq^® Total RNA High Input (RiboGone™ Mammalian)

SMART-Seq Total RNA High Input (RiboGone Mammalian) は、100 ng～1 μgのヒト、マウス、ラットのtotal RNAからインデックスを付加したイルミナ社次世代シーケンサー対応のライブラリーを調製するキットです。
RiboGone技術とSMART技術を組み合わせた一連の操作により、約5時間でリボソームRNA（rRNA）除去とstrand-specific RNA-Seqライブラリーの調製を行うことができます。
RiboGone技術により、ライブラリー調製前にtotal RNAの90％近くを占めているrRNAを効果的に除去することで、シーケンスコストを下げ、マッピングの精度（mapping statistics）を上げることができます。連続したSMART技術によって、方向性情報を維持しながら、逆転写反応、PCR増幅と同時にインデックス配列を付加することができ、コーディングRNAとノンコーディングRNAの両方の分析が可能なライブラリーを調製できます。
別売りのUnique Dual Index Kit（製品コード 634752～634756）と組み合わせることにより、最大384サンプルのマルチプレックス解析に対応可能です。

※以下のデータはSMART-Seq Total RNA High Input (RiboGone Mammalian)と同じ原理・性能のSMARTer Stranded Total RNA Sample Prep Kit - HI Mammalian（製品コード 634873～634878）で得たものを示しています。

図1. SMART-Seq Total RNA High Input (RiboGone Mammalian)を用いたライブラリー調製の概要
A：RiboGone技術によりtotal RNAからrRNAを除去
B：SMART技術により両末端に付加配列を持つ1st-strand cDNAを合成
C：PCRにより5'-、3'-両末端にIlluminaインデックス配列を持つRNA-Seqライブラリーを調製


表1．RIN値が異なるRNAから調製したライブラリーの評価

化学的にRIN 3またはRIN 7まで剪断したマウス肝臓RNAから本キットを用いてライブラリーを調製し、マッピングを行った。RNAの品質にかかわらず、高品質なライブラリー調製が可能であることが示された。



図2．テクニカルレプリケート間の再現性
100 ngのHuman Universal Reference RNA（HURR；Agilent）2サンプルよりRNA-Seqライブラリーを調製し、各ライブラリーのFPKMs（Fragments Per Kilobase Of Exon Per Million Fragments Mapped）の相関性を調べた。
両者間で高い相関を示し、テクニカルレプリケート間での再現性があることがわかった。



図3．RINが異なるRNA間の相関性テスト
化学的にRIN値3または7まで剪断したマウス肝臓RNA各1 μgからライブラリーを調製し、各ライブラリーのFPKMsの相関性を調べた。
RIN値が異なるサンプル間でも高い相関性を示した。



図4．RNA-seqデータとMAQCデータの相関性
SMARTer Stranded Total RNA Sample Prep Kit - HI Mammalian（製品コード 634873）を用いて各400 ngのHuman Universal Reference RNA（HURR）、およびHuman Brain Reference RNA（HBRR）からライブラリーを調製し、同じreference RNAを使用したMAQC（MicroArray Quality Control）qPCRデータとの相関性を調べた。
両者間で高い相関性を示した。



図5．RNA-Seqデータのダイナミックレンジと直線性
Human Brain Reference RNA（HBRR）にERCC Spike-In RNA MIX2を添加してライブラリーを調製した。
ERCC濃度と発現解析結果（FPKM）は高い相関性を示した。

Box1：－70℃
Box2：－20℃
（Stranded Elution Buffer：融解後は室温保存）

下記の製品はユーザーマニュアルに記載のProtocolで使用できることが確認されています。他製品では代替できないため、ご注意ください。

Index Kit

• Unique Dual Index Kit (1-24)（製品コード 634756）
  UDI No, U001-U024
• Unique Dual Index Kit (1-96)（製品コード 634752）
  UDI No, U001-U096
• Unique Dual Index Kit (97-192)（製品コード 634753）
  UDI No, U097-U192
• Unique Dual Index Kit (193-288)（製品コード 634754）
  UDI No, U193-U288
• Unique Dual Index Kit (289-384)（製品コード 634755）
  UDI No, U289-U384

サンプル調製

• 8-tube strips（Thermo Fisher Scientific社 Cat. No. AB0264）あるいはPCRラックや96-well plateに固定されたnuclease-free, PCR-grade tube strips
• Aluminum single tab foil seal（USA Scientific社, Cat. No. 2938-4100）、または cap strips（Thermo Fisher Scientific社, Cat. No. AB0784/AB0850）

PCR増幅およびバリデーション

• High Sensitivity DNA Kit（Agilent Technologies社, Cat. No. 5067-4626）
• Qubit dsDNA HS Assay Kit（Thermo Fisher Scientific社, Cat. No. Q32854）
• Nuclease-free, PCR-grade, thin-wall PCR strips（0.2 ml PCR 8-tube strip; Thermo Fisher Scientific社, Cat. No. AB0264）、あるいは類似のnuclease-free, PCR-grade, thin-wall PCR tubes, stripsか96-well plates
• Nuclease-free, low-adhesion 1.5 ml tubes（USA Scientific社, Cat. No. 1415-2600）または、DNA LoBind tubes（Eppendorf社, Cat. No. 022431021）

その他

• シングルチャンネルピペット：10 μl、20 μlおよび200 μl
• 8連、あるいは12連チャンネルピペット：20 μl、200 μl
• フィルターピペットチップ：10 μl、20 μl、および200 μl
• 1.5 mlチューブ用微量遠心機
• 0.2 mlチューブまたはstrip用微量遠心機
• PCRサーマルサイクラー　2台（pre-amplificationステップ用、PCR増幅用）
• NucleoMag NGS Clean-up and Size Select（5 ml size：製品コード 744970.5；50 ml size：製品コード 744970.50；500 ml size：製品コード 744970.500）
  ※NucleoMagの代わりにAMPure XP PCR purification kit（Beckman Coulter社 5 ml size：Cat. No. A63880；60 ml size：Cat. No. A63881）も使用可能
• 80％エタノール（用事調製）
• Magnetic Separation Device
  • 12～24サンプルの場合：SMARTer-Seq Magnetic Separator - PCR Strip（製品コード 635011）、0.2 mlチューブ用遠心機
  • 24～96サンプルの場合：Magnetic Stand 96（Thermo Fisher Scientific社 Cat. No. AM10027）、96-well plate用低速遠心機