SMARTer^® Human scTCR a/b Profiling Kit

T細胞をバルクでシーケンスすることは、T細胞受容体（TCR）レパトア解析に役立つが、T細胞内の特定のTCRα鎖-TCRβ鎖のペアリングを決定することはできない。標的免疫療法のためのTCRの効率的な設計、およびT細胞集団の先祖関係の確立には、特定のTCRα鎖-TCRβ鎖のペアが抗原特異性に関連するので、ペアリング情報を得ることは抗原認識に関する洞察を行うには重要である。従来法のシングルセルT細胞のシーケンスは、個々のT細胞における、TCRα鎖-TCRβ鎖のペアリングを決定することができるが、大量の細胞をシーケンスする必要があるため、非常にコストが高く、複雑な分析が必要であった。
SMARTer Human scTCR a/b Profiling Kitは、8種類のインデックスオリゴセットを用いることにより、マニュアルまたはセルソーターで分離された96個の細胞を、12個のシーケンス用ライブラリーとしてプールすることができ、この問題を解決することができる。さらに、12個のライブラリーにインデックス配列を付加することで、一つのフローセルレーン（MiSeq）でシーケンスすることができるため、96個のサンプルすべてを1度に解析できる。従来のバルク解析用のSMARTer Human TCR a/b profiling Kitと同様、本キットはSMART法によるcDNA合成とRACEベースのTCR遺伝子特異的PCRを組み合わせて、TCRα鎖およびTCRβ鎖の可変領域（VDJ）の全長を増幅することができるので、 高感度なTCRシーケンスが可能である。
本キットを用いて作製したシーケンスデータのdemultiplexの解析に関してはSMARTer Human scTCR Demultiplexerが利用可能である。

図1.
Panel A：SMARTer Human scTCR a/b Profiling Kitのワークフロー
Panel B：SMART-Seq Indexed Oligo Master Mixのプレートでの配置
サンプルは列ごとにプールされるので、各プールはそれぞれ異なるインデックスのSMART-Seq Indexed oligoを有する8種類の細胞サンプルを含む。PCR 2において、forwardおよびreverse HT Indexの異なる組み合わせを使用することにより、一つのフローセルレーンですべてのサンプルを識別することができる。

図2. シングルセルでのT細胞研究のメリット
Panel A：TCRα鎖およびTCRβ鎖からなるT細胞受容体の略図
Panel B：細胞集団から得た配列データからTCRα鎖およびTCRβ鎖のペアリング情報を得ることが困難であることを示した図。レアなクロノタイプ（オレンジ色）は1種類のペアリング情報を推定することが可能であるが、より高発現のクロノタイプ（TRA V2J1、TRA V1J2、TRB V3D1J1、TRB V2D1J2）は4種類のペアリング情報が推定される。

図3. 96well plateでの混合されたシングルセル細胞集団の解析
異なる既知のクロノタイプを発現しているJurkat細胞とCCRF-CEM細胞を1:1で混合後、セルソーターで96 well plateにシングルセル分離を行った。本キットを用いてTCRライブラリーを作製しシーケンス解析を行った。
Panel A：各ウェルで同定されたクロノタイプから細胞の型を確定した。 7つのウェル（グレー）は閾値以上のリード数であったが、TCRα鎖またはTCRβ鎖のクロノタイプを同定できなかったため除外された。
Panel B：ペアリング情報の解析。ペアで検出されたTCRα/TCRβクロノタイプは1プレート中、34個の細胞について得られた。
Panel C：TCRα単独、TCRβ単独、またはTCRα/TCRβベアで検出された細胞の割合。除外された細胞（7ウェル分）はこの結果に含まれていない。

Package 1：

• Control Jurkat Total RNA (1 μg/μl)
• SMART-Seq Indexed Oligo A (48 μM)
• SMART-Seq Indexed Oligo B (48 μM)
• SMART-Seq Indexed Oligo C (48 μM)
• SMART-Seq Indexed Oligo D (48 μM)
• SMART-Seq Indexed Oligo E (48 μM)
• SMART-Seq Indexed Oligo F (48 μM)
• SMART-Seq Indexed Oligo G (48 μM)
• SMART-Seq Indexed Oligo H (48 μM)

Package 2：

• RT Primer (12 μM)
• 5X Ultra Low First-Strand Buffer
• SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl)
• Nuclease-Free Water
• RNase Inhibitor (40 U/μl)
• 10× Lysis Buffer
• Elution Buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.5)
• SMART cDNA Primer (12 μM)
• cDNA Primer (12 μM)
• cDNA Amplification Polymerase
• cDNA Amplification Buffer (2X)
• TCRa Human Primer 1 (12 μM)
• TCRb Human Primer 1 (12 μM)
• TCR Primer 1 (12 μM)
• TCR Amplification Polymerase (1.25 U/μl)
• TCR Amplification Buffer (5X)
• TCR Amplification dNTP Mixture (2.5 mM each)

TCR a/b Human Indexing Primer Set HT for Illumina

12回用（製品コード 634431）

　TCRa Human Primer 2 Reverse HT Index 1 , (aR1; 12.5 μM)

　TCRa Human Primer 2 Reverse HT Index 1 , (bR1; 12.5 μM)

　TCR Primer 2 Forward HT Index 1 –12 (F1-F12; 12.5 μM)

48回用（製品コード 634432）

　TCRa Human Primer 2 Reverse HT Index 1-5 , (aR1-aR5; 12.5 μM)

　TCRa Human Primer 2 Reverse HT Index 1-5, (bR1-bR5; 12.5 μM)

　TCR Primer 2 Forward HT Index 1 –12 (F1-F12; 12.5 μM)

Package 1：－70℃
Package 2：－20℃
　　10X Lysis Buffer、Nuclease-Free Water：一度融解した後は4℃保存
　　Elution Buffer：一度融解した後は室温保存
　　その他：－20℃
TCR a/b Human Indexing Primer Set HT for Illumina：－20℃

下記の製品は本キット中に含まれません。下記の製品はユーザーマニュアルに記載のProtocolで使用できることが確認されています。他製品では代替はできないため、ご注意ください。

・シングルチャンネルピペット： 10 μl、20 μlおよび200 μl
・8連チャンネルピペット： 20 μl、200 μl
・フィルターピペットチップ： 10 μl、20 μlおよび200 μl
・微量遠心機（1.5 ml チューブ用、0.2 mlチューブまたはストリップ用）
・96ウエルプレート用遠心機

セルソーティング
・96-well polycarbonate PCR plates（USA Scientific Plastics, Cat No. 2796-3330）
・BD FACS Pre-Sort Buffer（BD, Cat No. 563503）
・チューブ・プレート用クーリングブロック（－20℃で保存してあらかじめ冷やしておく）
・Adhesive PCR Plate Foils（Thermo Fisher, Cat No. AB-0626）
・ドライアイス （細胞の凍結用）

PCR増幅およびバリデーション
・1st strand cDNA合成用のPCRサーマルサイクラー
・PCR amplification用のPCRサーマルサイクラー
・High Sensitivity DNA Kit（Agilent, Cat. No. 5067-4626）
・Agilent 2100 Bioanalyzer: DNA 1000 Kit (Agilent, Cat. No. 5067-1504）
・Nuclease-free thin-wall PCR tube（0.2 ml；USA Scientific社 Code 1402-4700）
・Nuclease-free-low adhesion1.5 ml tubes（USA Scientific社 Code 1415-2600）または
　　LoBond tubes (Eppendorf, No.022431021）

SPRI Bead精製
・Agencourt AMPure XP PCR Purification Kit（Beckman Coulter社; 5 ml, Code. A63880、60 ml, Code. A63881）
・0.2 mlチューブ用 Magnetic Separation Device（SMARTer-Seq Magnetic Separator - PCR Strip　製品コード 635011）など
・96-wellフォーマット magnetic separation device（オプション）
　　　96-well V-bottom Plate（500 μl; VWR, Cat. No. 47743-996）
　　　MicroAmp Clean Adhesive Seal（Thermo Fisher, Cat. No. 4306311）
　　　96-well plate用遠心機
・100％ Ethanol