Panel A. SMARTScribe Reverse Transcriptase による1st strand cDNA合成を行い、mRNAの5'末端に達するとテンプレートに依存しないヌクレオチドが付加される。
SMART UMI Oligoは、この付加されたヌクレオチドにアニーリングし、逆転写反応によってヌクレオチドの追加配列をfirst stranded cDNAに組み込むためのテンプレートとして機能する。(これがtemplate switching ステップに相当する)。次に、1 st strand cDNAを用いて2段階の遺伝子特異的PCR増幅を行う。(Panel Bの詳細を参照)。nested PCRの2 nd PCRの産物は、大部分のリードがB細胞受容体転写物にマッピングされる。
Panel B. 1st PCRは1st strand cDNAをテンプレートにして、イルミナの Read 2 Primer配列と相補的なフォワードプライマー(PCR1 Universal Forward primer)とBCRの H鎖またはL鎖の定常領域(非可変領域)に相補的なリバースプライマー(PCR1 IgG/IgM/IgK/IgL Reverse primer)で行う。
Read 2 Primer配列と定常領域から増幅することにより、1st PCRではBCRのH鎖またはL鎖のcDNAの可変領域全体と大部分の定常領域を特異的に増幅する。2nd PCRは 1st PCRの産物をテンプレートにして、semi-nested プライマー(PCR2 IgG/IgM/IgK/IgL Reverse primer)を使用してBCRのH鎖またはL鎖のcDNAの可変領域全体と定常領域の部分を増幅する。
図2.1~100 ngのB細胞RNAから同定されたクロノタイプカウント
1 ng、10 ng、および100 ngのヒトCD19+ B細胞由来total RNAから本製品を用いてBCRプロファイリングIgG、IgM、IgK、およびIgLライブラリーを作製した。1 ng、10 ng、100 ngのRNAインプットのライブラリーに対して、各々100,000リード、400,000リード、5,000,000リードにダウンサンプリングして解析した。インプットRNA量が増えるとクロノタイプカウントが増加し、RNA量が少なく複雑性の高いサンプルでも安定したデータが取得された。
図3.1 μgのPBMC RNAから作製されたライブラリー間の再現性を示すスキャッタープロット
健常人ドナーからのPBMC由来のRNA 1μgからIgG、IgM、IgK、およびIgLのライブラリーを2連で作製した。ライブラリーは13Mリードにダウンサンプリングして解析された。プロットには、複製した4つのライブラリー(IgG、IgM、IgK、およびIgL)がすべて含まれている。1 μgのPBMC RNAを用いて行った場合、ピアソン相関係数は0.98、スピアマン相関係数は0.72になり高い再現性を示した。
図4.さまざまなドナーから取得したPBMC RNAのクロノタイプカウント
8人のドナー(異なる色で表示)からのPBMC RNAの各10 ngからSMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kitを使用してIgG、IgM、IgK、およびIgLクロノタイプを決定した。解析はすべて100,000リードにノーマライズされた。クロノタイプカウントはサンプルによって異なるが、本キットを使用すれば様々なクロノタイプが検出された。
図5.10 ng PBMC RNAライブラリーのシーケンス飽和の評価
SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kitを使用して単一ドナーからのPBMC RNA10 ngからBCR Profilingライブラリーを調製した。
Panel A. 異なるシーケンスdepthでのIgGクロノタイプカウントを、UMIベースのエラー補正あり(青線)となし(紫線)で示した。 IgGおよびその他の鎖(IgM、IgK、およびIgLは未掲載)をライブラリーごとに150万リードで配列決定し、100万、500K、200K、100K、50K、10K、および5Kリードにダウンサンプリングし、さまざまなシーケンスdepthで解析を行った。UMIを用いることで、正確性の高いクロノタイプを検出した。
Panel B. 100K(低depth)および1,500K(高depth)のライブラリー間で重複したクロノタイプを示した。