SMART-Seq^® Human BCR (with UMIs)

SMART-Seq Human BCR (with UMIs)は、5'RACE法とNGSテクノロジーを組み合わせた高感度で正確かつ最適化されたアプローチを提供することにより、RNAサンプルから、ヒトBCRレパトア解析用の高品質ライブラリー調製が可能なキットである。5'RACE法の採用によりバイアスを減らし、BCRのH鎖またはL鎖の定常領域からのプライミングを可能にする。本キットは、遺伝子特異的増幅におけるこれらの利点を組み合わせて、BCR転写産物のV（D）J可変領域全体をキャプチャーし、高感度で再現性の高いB細胞レパトア解析を可能にする。
本キットは、末梢血単核細胞（PBMC）から精製した10 ng～1 µgのtotal RNAまたはB細胞から精製した1～100 ngのtotal RNAから、高品質のイルミナ社次世代シーケンサー用ライブラリーを調製し、同一サンプルから異なる鎖（IgG、IgM、IgA、IgD、IgE、IgK、IgL）を高感度に検出することができる。本キットには、分子バーコード（UMI）が含まれており、PCRエラー、duplicateやシーケンスエラーに由来するリードを除去できるため、より正確で信頼性の高い結果が得られる。

図1．SMART-Seq Human BCR (with UMIs)のワークフロー
SMARTScribe Reverse Transcriptase による1st strand cDNA合成を行い、mRNAの5'末端に達するとテンプレートに依存しないヌクレオチドが付加される。
SMART UMI Oligoは、この付加されたヌクレオチドにアニーリングし、逆転写反応によってヌクレオチドの追加配列をfirst stranded cDNAに組み込むためのテンプレートとして機能する。（これがtemplate switchingステップに相当する）次に、1 st strand cDNAを用いて2段階の遺伝子特異的PCR増幅を行う。nested PCRの2 nd PCRの産物は、大部分のリードがB細胞受容体転写物にマッピングされる。


図2．幅広いRNA量から同定された高感度かつ再現性の高いクロノタイプ
SMART-Seq Human BCR（with UMIs）を用いて、10、100、1,000 ngのヒトPBMC由来total RNAからヒトBCR重鎖（IgA/D/E/G/M）および軽鎖（IgK/L）ライブラリーを作製し、解析した。サンプル量に関わらず、安定した結果が得られた。


図3．インプット量に応じた一貫性を示すクロノタイプカウント
さまざまなインプット量のPBMC RNAおよびB細胞RNAから本製品を用いてヒトBCRライブラリーを調製した。
PBMC RNA（パネルA）では、200万リード、600万リード、1,200万リード、B細胞RNA（パネルB）では100万リード、500万リード、1,200万リードにダウンサンプリングし、解析した。インプットRNA量が増えるとクロノタイプカウントも増加し、さまざまなインプット量のサンプルでも安定したデータを取得できることが示された。（HC=重鎖、LC=軽鎖）


図4．既存製品（SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit）、他社製品とのデータ品質の比較
10 ngのヒトPBMC Total RNAから、本製品（BCRv2）と既存製品（BCRv1）、および他社製品（N社）を用いてライブラリーを調製し、イルミナ社プラットフォームで配列決定した。
パネルA. シーケンス後、すべてのライブラリーを100万リード以下までダウンサンプリングした。BCRv2は、既存製品に比べ、約5.5倍多くのクロノタイプを検出した。
パネルB. N社のライブラリーは100万リード、BCRv2のライブラリーは重鎖・軽鎖それぞれ50万リードまでダウンサンプリングした。BCRv2は重鎖（HC）と軽鎖（LC）それぞれのアイソタイプで約9,500リードと22,900リードのクロノタイプを生成し、N社に対して1.27倍のクロノタイプカウントを得られた。


図5．高感度な少量クロノタイプ検出
10 ngのPBMC RNAにTIB-190細胞株から抽出したRNAを100 pg、10 pg、1 pg、0.1 pgスパイクインした。
パネルA. 各RNA量をスパイクインした際に検出されたクローン数を表に示した。ライブラリーは20万リードにノーマライゼーションし、UMIを用いたエラー補正後にすべてのカウントを測定した。
パネルB. スパイクインRNAの割合と検出されたクロノタイプの相関を示した（グラフは両軸とも対数変換済み）。本製品で検出したスパイクインRNAサンプル（濃度0.001％～）とクロノタイプは、正の相関を示した。


図6．レプリケート間、シーケンスプラットフォーム間での高い再現性
本製品を用いて10 ngのPBMC RNAと1 ngのB細胞RNAからBCRライブラリーを調製した。
パネルA. 10 ng PBMC RNAからライブラリー調製し、イルミナ社 Miseqプラットフォームでシーケンスした2つのテクニカルレプリケートは、高いクロノタイプ重複（87％）を示した。
パネルB. 1 ngのB細胞からライブラリー調製し、MiSeq用試薬キットV3（600サイクル）とV2（300サイクル）を用いてシーケンスしたライブラリーを比較した。同様に、MiSeq（600サイクル）とMiniSeq（300サイクル）も比較した。すべてのライブラリーは100万リードにダウンサンプリングし、解析を行った。どちらの比較においても、85％、87％と高いクロノタイプ重複を示した。


図7．既存製品（SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit）との検出アイソタイプの比較
各アイソタイプで、既存製品よりも多くのクロノタイプカウントを取得できた。


図8．バイオロジカルレプリケートにおける、クロノタイプ上位100個の相関解析

Box 1:

Control Total RNA^※ (1 μg/μl)
SMART UMI Oligo

Box 2:

dT Primer
First-Strand Buffer (5X)
SMARTScribe Reverse Transcriptase
Nuclease-Free Water
BCR Enhancer
RNase Inhibitor (40 U/μl)
Elution Buffer (10 mM Tris HCl, pH 8.5)
hBCR PCR1 Universal Forward
hBCR PCR1 Reverse
hBCR PCR2 HC Reverse
hBCR PCR2 LC Reverse
PrimeSTAR GXL Premix

※ コントロールRNAはヒト脾臓Total RNA

Box 1：－70℃
Box 2：－20℃

• Unique Dual Index Kit
  
  • Unique Dual Index Kit (1-24)（製品コード 634756）
    UDI No. U001-U024
  • Unique Dual Index Kit (1-96)（製品コード 634752）
    UDI No, U001-U096
  • Unique Dual Index Kit (97-192)（製品コード 634753）
    UDI No, U097-U192
  • Unique Dual Index Kit (193-288)（製品コード 634754）
    UDI No, U193-U288
  • Unique Dual Index Kit (289-384)（製品コード 634755）
    UDI No, U289-U384

PCR増幅およびバリデーション

• 1st strand cDNA合成専用のPCRサーマルサイクラー
• PCR amplification用のPCRサーマルサイクラー
• Agilent 2100 Bioanalyzer : DNA 1000 Kit (Agilent社, code. 5067-1504)
• Qubit dsDNA HS Kit (Thermo Fisher Scientific, code. Q32851)
• Nuclease-free thin-wall PCR tube（0.2 ml；USA Scientific社 Code 1402-4700）または同等のNuclease-free thin-wall PCR tube stripsまたは96-well Plate
• Nuclease-free low adhesion 1.5 ml tube（USA Scientific社 Code 1415-2600）またはDNA LoBond tube（Eppendorf社 Code.022431021）または同等のnucleic acid low-binding tubes

SPRI Bead精製

• NucleoMag NGS Clean-up and Size Select（5 ml size : 製品コード 744970.5; 50 ml size : 製品コード 744970.50; 500 ml size: 製品コード 744970.500）
  ※NucleoMagの代わりにAMPure XP PCR purification kit（Beckman Coulter社; 5 ml size: code. A63880; 60 ml size: code. A63881）も使用可能
• 100％ Ethanol
• Magnetic Separation Device
  • 8-tube strips用 : SMARTer-Seq Magnetic Separator - PCR Strip（製品コード 635011）
  • 96-well plates用 : Magnetic Stand-96 (Thermo Fisher Scientific社, code. AM10027)
• Magnetic Separation Deviceの種類（96-well format）により、別途必要なもの
  • 96-well V-bottom Plate (500 μl; VWR, code. 47743-996)
  • MicroAmp クリーン粘着シール (Thermo Fisher Scientific社, code. 4306311)
• 96ウェルプレート用卓上低速遠心分離機

その他

• シングルチャンネルピペット： 10 μl、20 μlおよび200 μl
• 8連チャンネルピペット： 20 μl、200 μl
• フィルターピペットチップ： 2 μl、20 μlおよび200 μl
• 微量遠心機 (1.5 ml チューブ用、0.2 mlチューブまたはストリップ用)