SMART-Seq® Human BCR (with UMIs)

ヒトBCR H鎖/L鎖の可変領域の完全長シーケンス
  • 同一サンプルから異なる鎖(IgG、IgM、IgA、IgD、IgE、IgK、IgL)を高感度に検出するために最適化された反応系
  • 多様な組織、細胞からのtotal RNAサンプルに対応
  • 分子バーコード(UMI)により、PCRエラー/duplicate/シーケンスエラーに由来するリードを補正
  • Unique Dual Index Kit(別売り)の使用により、インデックスホッピングの影響を軽減
製品コード メーカー
略称
製品名 容量 価格(税別)
キャンペーン価格
特記事項 説明書、CoA
データシート
ベクター情報
参考資料 カート
Takara Code
634777

CLN

Clontech
SMART-Seq® Human BCR (with UMIs)
NGS関連 -RNAシーケンス編- 化学物質排出把握管理促進法(PRTR法) 安全データシート(SDS)添付 ライセンス
24回 ¥285,000
¥228,000
2023/11/27~
2024/03/29

30%OFFモニターキャンペーン実施中!
説明書・データシート・ベクター情報
Z4777N
634778

CLN

Clontech
SMART-Seq® Human BCR (with UMIs)
NGS関連 -RNAシーケンス編- 化学物質排出把握管理促進法(PRTR法) 安全データシート(SDS)添付 ライセンス
96回 ¥1,018,000
¥814,400
2023/11/27~
2024/03/29

説明書・データシート・ベクター情報
Z4778N
634776

CLN

Clontech
SMART-Seq® Human BCR (with UMIs)
NGS関連 -RNAシーケンス編- 化学物質排出把握管理促進法(PRTR法) 安全データシート(SDS)添付 ライセンス
96回×4 ¥3,837,000
¥3,069,600
2023/11/27~
2024/03/29

説明書・データシート・ベクター情報
Z4776N
634756

CLN

Clontech
Unique Dual Index Kit (1-24)
24回 ¥34,000
説明書・データシート・ベクター情報
Z4756N
634752

CLN

Clontech
Unique Dual Index Kit (1-96)
96回 ¥87,000
説明書・データシート・ベクター情報
Z4752N
634753

CLN

Clontech
Unique Dual Index Kit (97-192)
96回 ¥87,000
説明書・データシート・ベクター情報
Z4753N
634754

CLN

Clontech
Unique Dual Index Kit (193-288)
96回 ¥87,000
説明書・データシート・ベクター情報
Z4754N
634755

CLN

Clontech
Unique Dual Index Kit (289-384)
96回 ¥87,000
説明書・データシート・ベクター情報
Z4755N
※色文字での表示は、キャンペーン価格およびそのキャンペーン期間です。
本キットにはIndexが含まれていません。Unique Dual Index Kit(製品コード 634752/634753/634754/634755/634756)を別途ご購入ください。
シーケンスを行う際には、サンプルにControl DNA(PhiX)を加えて解析してください。
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製品説明

SMART-Seq Human BCR (with UMIs)は、5'RACE法とNGSテクノロジーを組み合わせた高感度で正確かつ最適化されたアプローチを提供することにより、RNAサンプルから、ヒトBCRレパトア解析用の高品質ライブラリー調製が可能なキットである。5'RACE法の採用によりバイアスを減らし、BCRのH鎖またはL鎖の定常領域からのプライミングを可能にする。本キットは、遺伝子特異的増幅におけるこれらの利点を組み合わせて、BCR転写産物のV(D)J可変領域全体をキャプチャーし、高感度で再現性の高いB細胞レパトア解析を可能にする。
本キットは、末梢血単核細胞(PBMC)から精製した10 ng~1 µgのtotal RNAまたはB細胞から精製した1~100 ngのtotal RNAから、高品質のイルミナ社次世代シーケンサー用ライブラリーを調製し、同一サンプルから異なる鎖(IgG、IgM、IgA、IgD、IgE、IgK、IgL)を高感度に検出することができる。本キットには、分子バーコード(UMI)が含まれており、PCRエラー、duplicateやシーケンスエラーに由来するリードを除去できるため、より正確で信頼性の高い結果が得られる。
SMART-Seq Human BCR (with UMIs)のワークフロー
図1.SMART-Seq Human BCR (with UMIs)のワークフロー
SMARTScribe Reverse Transcriptase による1st strand cDNA合成を行い、mRNAの5'末端に達するとテンプレートに依存しないヌクレオチドが付加される。
SMART UMI Oligoは、この付加されたヌクレオチドにアニーリングし、逆転写反応によってヌクレオチドの追加配列をfirst stranded cDNAに組み込むためのテンプレートとして機能する。(これがtemplate switchingステップに相当する)次に、1 st strand cDNAを用いて2段階の遺伝子特異的PCR増幅を行う。nested PCRの2 nd PCRの産物は、大部分のリードがB細胞受容体転写物にマッピングされる。

幅広いRNA量から同定された高感度かつ再現性の高いクロノタイプ
図2.幅広いRNA量から同定された高感度かつ再現性の高いクロノタイプ
SMART-Seq Human BCR(with UMIs)を用いて、10、100、1,000 ngのヒトPBMC由来total RNAからヒトBCR重鎖(IgA/D/E/G/M)および軽鎖(IgK/L)ライブラリーを作製し、解析した。サンプル量に関わらず、安定した結果が得られた。

インプット量に応じた一貫性を示すクロノタイプカウント
図3.インプット量に応じた一貫性を示すクロノタイプカウント
さまざまなインプット量のPBMC RNAおよびB細胞RNAから本製品を用いてヒトBCRライブラリーを調製した。
PBMC RNA(パネルA)では、200万リード、600万リード、1,200万リード、B細胞RNA(パネルB)では100万リード、500万リード、1,200万リードにダウンサンプリングし、解析した。インプットRNA量が増えるとクロノタイプカウントも増加し、さまざまなインプット量のサンプルでも安定したデータを取得できることが示された。(HC=重鎖、LC=軽鎖)

既存製品(SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit)、他社製品とのデータ品質の比較
図4.既存製品(SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit)、他社製品とのデータ品質の比較
10 ngのヒトPBMC Total RNAから、本製品(BCRv2)と既存製品(BCRv1)、および他社製品(N社)を用いてライブラリーを調製し、イルミナ社プラットフォームで配列決定した。
パネルA. シーケンス後、すべてのライブラリーを100万リード以下までダウンサンプリングした。BCRv2は、既存製品に比べ、約5.5倍多くのクロノタイプを検出した。
パネルB. N社のライブラリーは100万リード、BCRv2のライブラリーは重鎖・軽鎖それぞれ50万リードまでダウンサンプリングした。BCRv2は重鎖(HC)と軽鎖(LC)それぞれのアイソタイプで約9,500リードと22,900リードのクロノタイプを生成し、N社に対して1.27倍のクロノタイプカウントを得られた。

高感度な少量クロノタイプ検出
図5.高感度な少量クロノタイプ検出
10 ngのPBMC RNAにTIB-190細胞株から抽出したRNAを100 pg、10 pg、1 pg、0.1 pgスパイクインした。
パネルA. 各RNA量をスパイクインした際に検出されたクローン数を表に示した。ライブラリーは20万リードにノーマライゼーションし、UMIを用いたエラー補正後にすべてのカウントを測定した。
パネルB. スパイクインRNAの割合と検出されたクロノタイプの相関を示した(グラフは両軸とも対数変換済み)。本製品で検出したスパイクインRNAサンプル(濃度0.001%~)とクロノタイプは、正の相関を示した。

レプリケート間、シーケンスプラットフォーム間での高い再現性
図6.レプリケート間、シーケンスプラットフォーム間での高い再現性
本製品を用いて10 ngのPBMC RNAと1 ngのB細胞RNAからBCRライブラリーを調製した。
パネルA. 10 ng PBMC RNAからライブラリー調製し、イルミナ社 Miseqプラットフォームでシーケンスした2つのテクニカルレプリケートは、高いクロノタイプ重複(87%)を示した。
パネルB. 1 ngのB細胞からライブラリー調製し、MiSeq用試薬キットV3(600サイクル)とV2(300サイクル)を用いてシーケンスしたライブラリーを比較した。同様に、MiSeq(600サイクル)とMiniSeq(300サイクル)も比較した。すべてのライブラリーは100万リードにダウンサンプリングし、解析を行った。どちらの比較においても、85%、87%と高いクロノタイプ重複を示した。

既存製品(SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit)との検出アイソタイプの比較
図7.既存製品(SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit)との検出アイソタイプの比較
各アイソタイプで、既存製品よりも多くのクロノタイプカウントを取得できた。

バイオロジカルレプリケートにおける、クロノタイプ上位100個の相関解析
図8.バイオロジカルレプリケートにおける、クロノタイプ上位100個の相関解析

内容

Box 1:
Control Total RNA (1 μg/μl)
SMART UMI Oligo

Box 2:
dT Primer
First-Strand Buffer (5X)
SMARTScribe Reverse Transcriptase
Nuclease-Free Water
BCR Enhancer
RNase Inhibitor (40 U/μl)
Elution Buffer (10 mM Tris HCl, pH 8.5)
hBCR PCR1 Universal Forward
hBCR PCR1 Reverse
hBCR PCR2 HC Reverse
hBCR PCR2 LC Reverse
PrimeSTAR GXL Premix

コントロールRNAはヒト脾臓Total RNA

保存

Box 1:-70℃
Box 2:-20℃
BCR Enhancer, Nuclease-Free Water:-20℃保存。一度融解した後は4℃保存
Elution Buffer: -20℃保存。一度融解した後は室温保存。
その他:-20℃

本製品以外に必要な試薬、機器(主なもの)

  • Unique Dual Index Kit
    • Unique Dual Index Kit (1-24)(製品コード 634756)
      UDI No. U001-U024
    • Unique Dual Index Kit (1-96)(製品コード 634752)
      UDI No, U001-U096
    • Unique Dual Index Kit (97-192)(製品コード 634753)
      UDI No, U097-U192
    • Unique Dual Index Kit (193-288)(製品コード 634754)
      UDI No, U193-U288
    • Unique Dual Index Kit (289-384)(製品コード 634755)
      UDI No, U289-U384

PCR増幅およびバリデーション
  • 1st strand cDNA合成専用のPCRサーマルサイクラー
  • PCR amplification用のPCRサーマルサイクラー
  • Agilent 2100 Bioanalyzer : DNA 1000 Kit (Agilent社, code. 5067-1504)
  • Qubit dsDNA HS Kit (Thermo Fisher Scientific, code. Q32851)
  • Nuclease-free thin-wall PCR tube(0.2 ml;USA Scientific社 Code 1402-4700)または同等のNuclease-free thin-wall PCR tube stripsまたは96-well Plate
  • Nuclease-free low adhesion 1.5 ml tube(USA Scientific社 Code 1415-2600)またはDNA LoBond tube(Eppendorf社 Code.022431021)または同等のnucleic acid low-binding tubes

SPRI Bead精製
  • NucleoMag NGS Clean-up and Size Select(5 ml size : 製品コード 744970.5; 50 ml size : 製品コード 744970.50; 500 ml size: 製品コード 744970.500)
    ※NucleoMagの代わりにAMPure XP PCR purification kit(Beckman Coulter社; 5 ml size: code. A63880; 60 ml size: code. A63881)も使用可能
  • 100% Ethanol
  • Magnetic Separation Device
    • 8-tube strips用 : SMARTer-Seq Magnetic Separator - PCR Strip(製品コード 635011)
    • 96-well plates用 : Magnetic Stand-96 (Thermo Fisher Scientific社, code. AM10027)
  • Magnetic Separation Deviceの種類(96-well format)により、別途必要なもの
    • 96-well V-bottom Plate (500 μl; VWR, code. 47743-996)
    • MicroAmp クリーン粘着シール (Thermo Fisher Scientific社, code. 4306311)
  • 96ウェルプレート用卓上低速遠心分離機

その他
  • シングルチャンネルピペット: 10 μl、20 μlおよび200 μl
  • 8連チャンネルピペット: 20 μl、200 μl
  • フィルターピペットチップ: 2 μl、20 μlおよび200 μl
  • 微量遠心機 (1.5 ml チューブ用、0.2 mlチューブまたはストリップ用)
注意事項
  • 本ページの製品はすべて研究用として販売しております。ヒト、動物への医療、臨床診断用には使用しないようご注意ください。また、食品、化粧品、家庭用品等として使用しないでください。
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