SMART-Seq® Human TCR (with UMIs)

UMI搭載！ヒトTCRα/β V(D)J可変領域の完全長シーケンスが可能
  • イルミナ社次世代シーケンサー用ヒトT細胞受容体（TCR）のレパトア解析ライブラリー調製キット
  • 末梢血白血球total RNA 10 ng～1 μg、T細胞total RNA 1～100 ng、全血total RNA 20～200 ng、T細胞 1,000～10,000個から調製可能
  • 完全長V(D)J可変領域のシーケンス（MiSeq推奨）やCDR3配列のシーケンス（イルミナ社全シーケンサー）が可能
  • 分子バーコード（UMI）やUnique Dual Indexの利用でより正確なNGS解析が可能

注： SMART-Seq Human TCR (with UMI)は、SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit v2（製品コード 634478、634479）のリニューアル製品です。基本性能、プロトコールに変更はありませんが、インデックスが別売りとなっていますので、必ず別途ご購入ください。（Unique Dual Index [UDI] kits参照）
製品コード メーカー
略称		 製品名 容量 価格（税別） 特記事項 説明書、CoA
データシート
ベクター情報		 参考資料 カート
Takara Code
634780

CLN

Clontech
 SMART-Seq® Human TCR (with UMIs)
化学物質排出把握管理促進法（PRTR法） 安全データシート（SDS）添付
24回 ￥285,000
 30％OFFモニターキャンペーン実施中！
 説明書・データシート・ベクター情報 個
Z4780N
634781

CLN

Clontech
 SMART-Seq® Human TCR (with UMIs)
化学物質排出把握管理促進法（PRTR法） 安全データシート（SDS）添付
96回 ￥1,018,000
 説明書・データシート・ベクター情報 個
Z4781N
634779

CLN

Clontech
 SMART-Seq® Human TCR (with UMIs)
化学物質排出把握管理促進法（PRTR法） 安全データシート（SDS）添付
96回×4 ￥3,837,000
 説明書・データシート・ベクター情報 個
Z4779N
634756

CLN

Clontech
 Unique Dual Index Kit (1-24)
24回 ￥34,000
 説明書・データシート・ベクター情報 個
Z4756N
634752

CLN

Clontech
 Unique Dual Index Kit (1-96)
96回 ￥87,000
 説明書・データシート・ベクター情報 個
Z4752N
634753

CLN

Clontech
 Unique Dual Index Kit (97-192)
96回 ￥87,000
 説明書・データシート・ベクター情報 個
Z4753N
634754

CLN

Clontech
 Unique Dual Index Kit (193-288)
96回 ￥87,000
 説明書・データシート・ベクター情報 個
Z4754N
634755

CLN

Clontech
 Unique Dual Index Kit (289-384)
96回 ￥87,000
 説明書・データシート・ベクター情報 個
Z4755N
※本キットにはIndexが含まれていません。Unique Dual Index Kit（製品コード 634752/634753/634754/634755/634756）を別途ご購入ください。
※シーケンスを行う際には、サンプルにControl DNA（PhiX）を加えて解析してください。
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製品説明

SMART-Seq Human TCR (with UMIs)は、イルミナ社次世代シーケンサーを用いたヒトT細胞受容体（TCR）のレパトア解析用ライブラリー調製キットです。本製品はSMARTテクノロジー（Switching Mechanism at 5’End of RNA Template）と5' RACE法の応用によりTCRα鎖、β鎖の完全長V(D)J可変領域の配列を得ることが可能です。
ヒト末梢血白血球のtotal RNA（10 ng～1 μg）、T細胞の1～100 ng total RNA、あるいはインタクトなリンパ球（精製済みT細胞 1,000～10,000個）から高品質のライブラリーが調製できます。本キットでは、個別の分子バーコード（Unique Molecular Identifier : UMI）を付加することにより、PCR増幅バイアスによる影響を取り除き、より正確で信頼性の高いNGS解析が可能です。さらに、最大384個のマルチプレックスイルミナライブラリー調製が可能なユニークデュアルインデックス（Unique Dual Index Kit：別売り）により、インデックスホッピングによる他サンプルのライブラリー由来のリードコンタミネーションを防止できます。

サンプルサンプル量
PBMC由来total RNA10 ng～1 μg
T細胞由来total RNA1～100 ng
全血由来total RNA20～200 ng
T細胞1,000～10,000細胞
SMART-Seq Human TCR (with UMIs)を用いたライブラリー調製の概要
図1．SMART-Seq Human TCR (with UMIs)を用いたライブラリー調製の概要

さまざまなRNA量からのクロノタイプの検出
図2．さまざまなRNA量からのクロノタイプの検出
ヒトCD3＋T細胞からの各total RNA量または各細胞数からTRAとTRBライブラリーを調製した。得られたシーケンスリードを解析した。

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表1. SMART-Seq Human TCR (with UMIs)の感度と再現性
％ Jurkat RNA spiked in to 100 ng of PBMC RNATotal read count (TRA/TRB)Without UMI collapseWith UMI collapse
＃ of TRB raw reads＃ of reads for TRBV12-3-TRBJ1-2Detected percentage of Jurkat reads＃ of detected UMIs＃ of UMIs for TRBV12-3-TRBJ1-2Detected percentage of Jurkat UMIs
10.0％2,500,0001,565,005397,17925.00％281,28062,62922.0％
1.0％2,500,0001,422,10247,1603.3％219,7766,4262.9％
0.10％2,500,0001,366,1275,4120.4％189,5806310.33％
0.01％2,500,0001,218,0255210.043％196,615740.038％
0.001％2,500,0001,331,4659090.068％197,87060.003％
0.0001％2,500,0001,409,199－0％124,149－0％
0％2,500,0001,222,245－0％197,933－0％
PBMC RNAに白血病細胞Jurkat T細胞（TRBV12-3-TRBJ1-2クロノタイプ）のRNAを各濃度（10％、1％、0.1％、0.01％、0.001％、0.0001％）となるようにスパイクインし、本キットで解析した。100 ng total RNAからTRB CDR3領域を増幅し、イルミナ社NextSeqでシーケンスして、2.5 Mリードを解析した。UMIによるデータ補正をしなかった場合（Without UMI collapse）とUMIによるデータ補正をした場合（With UMI collapse）のスパイクインRNA濃度の検出限界をグレーの網掛けで示している。UMIによるデータ補正がない場合、TRBV12-3の検出限界は0.01％であったが、UMIによるデータ補正を行った場合は、0.001％まで検出できた。

他社キットとの比較
図3. 他社キットとの比較
2検体のPBMCからtotal RNAとgDNAを精製した。1.6 μgのgDNA（Y社）と100 ngのRNA（本キット、X社）から、それぞれライブラリーを調製した。各社キットの使用により得られたTCR α/βライブラリーのクロノタイプの数を示す。本キットでは、TRAが平均48.7 K、TRBが163 K得られた。(NT: not tested)

広範なサンプルタイプとRNA量からの高感度かつ再現性の高いクロノタイプ検出
図4. 広範なサンプルタイプとRNA量からの高感度かつ再現性の高いクロノタイプ検出
Panel A～Cで示しているTRA、TRBのライブラリーを以下に記載したサンプル、RNA量から調製し、解析した。
Panel A：ヒトCD3+細胞のtotal RNA 1、10、 100 ng
Panel B：CD3+T細胞1,000細胞と10,000細胞
Panel C：異なる3サンプルから抽出した全血RNA 20 ng
RNA精製やT細胞の単離の必要なく、多様で複雑なRNAに対応が可能ということが示された。

広範なクロノタイプカウントの同定
図5. 広範なクロノタイプカウントの同定
シングルドナーのPBMCサンプル（P1～P6）から抽出したRNA 10 ngを用い、それぞれのライブラリーを調製した。シーケンスはイルミナ社のMiSeqを用いて300 bpペアエンドリードで行い、1サンプルあたり150万リードを得た。それぞれのドナーから得られたTRA（青）とTRB（オレンジ）のクロノタイプ数をグラフに示した。エラーバーは各サンプルから調製したライブラリー間の標準偏差を示す。
検出されたクロノタイプの数によって生物学的変動を明らかにすることが可能である。

他社製品を圧倒する感度
図6. 他社製品を圧倒する感度
RNAとgDNA抽出用に、健康な2人のドナーから5M PBMC細胞を単離した。ライブラリーは各社の調製方法に従い、1.6 gのgDNA（抽出したtotal gDNAの15％）、100 ngのRNA（抽出したtotal RNAの2％）から調製した。
ダウンサンプリング後のTRBライブラリーにおいて、他社製品よりも劇的に高いクロノタイプ数を得られた（TRAも同様の結果のため示さず）。

内容

SMART-Seq Human TCR (with UMIs)（製品コード 634780/634781/634779）
Box 1
  • Control RNA (1 μg/μl)
  • TCR SMART UMI Oligo (48 μM)

Box 2
  • 10X Lysis Buffer
  • 5X Ultra Low First-Strand Buffer
  • TCR dT Primer (12 μM)
  • SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl)
  • RNase Inhibitor (40 U/μl)
  • Elution Buffer (10 mM)
  • Nuclease-Free Water
  • PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (1.25 U/μl)
  • 5X PrimeSTAR GXL Buffer
  • dNTP Mix (2.5 mM each)
  • hTCR PCR1 Universal Forward (12 μM)
  • hTCRa PCR1 Reverse (12 μM)
  • hTCRb PCR1 Reverse (12 μM)
  • hTCRa PCR2 UDI Reverse (12 μM)
  • hTCRb PCR2 UDI Reverse (12 μM)

保存

SMART-Seq Human TCR (with UMIs) Components
　　Box 1：－70℃
　　その他のコンポーネント：－20℃
　　（融解後、Box 2中の10X Lysis Bufferは4℃、Elution Bufferは室温に保存）

本製品以外に必要な試薬、機器（主なもの）

下記の製品は本キット中に含まれません。下記の製品はユーザーマニュアルに記載のProtocolで使用できることが確認されています。他製品では代替はできないため、ご注意ください。
Index Kit
  • Unique Dual Index Kit (1-24)（製品コード 634756）
    UDI No. U001-U024
  • Unique Dual Index Kit (1-96)（製品コード 634752）
    UDI No, U001-U096
  • Unique Dual Index Kit (97-192)（製品コード 634753）
    UDI No, U097-U192
  • Unique Dual Index Kit (193-288)（製品コード 634754）
    UDI No, U193-U288
  • Unique Dual Index Kit (289-384)（製品コード 634755）
    UDI No, U289-U384

PCR増幅およびバリデーション
  • First-Strand cDNA合成用のPCRサーマルサイクラー
  • PCR amplification用のPCRサーマルサイクラー
  • Qubit dsDNA HS Kit（Thermo Fisher Scientific社, Code. Q32851）
  • Agilent High Sensitivity DNA Kit (Agilent, Code. 5067-4626) 、Agilent DNA 1000 Kit（Agilent, Code. 5067-1504）、The Agilent 4150/2200 TapeStation with High Sensitivity D5000 ScreenTape (Agilent, Code. 5067-5592)、High Sensitivity D1000 ScreenTape (Agilent, Code. 5067-5584)、an Agilent Fragment Analyzer with the HS NGS Fragment Kit (Agilent, Code. DNF-474)またはQubit dsDNA HS Kit (Thermo Fisher Scientific, Code. Q32851)
  • Nuclease-free thin-wall PCR tube（0.2 ml；USA Scientific社 Code 1402-4700）
  • Nuclease-free-low adhesion1.5 ml tubes（USA Scientific社 Code 1415-2600）、LoBond tubes（Eppendorf, No.022431021）またはこれらと同等品

Bead精製
  • NucleoMag NGS Clean-up and Size Select（製品コード 744970.5／.50／.500）
    NucleoMag NGS Clean-up and Size Select がない場合の代替品：the AMPure XP PCR purification kit (Beckman Coulter; 5 ml size: Code. A63880; 60 ml size: Code. A63881)がNucleoMag NGS Clean-Up and Size Selectと同じ比率のビーズとサンプルで使用可能。
    注意
    • 本キットは上記のビーズで検証されており、他の製品を代用した場合、予期せぬ結果を招くことがあります。
    • ビーズは室温に戻してから容器を開けてください。ビーズを1.5 ml チューブに分注し、冷蔵保存することを推奨します。実験ごとに分注したチューブを取り出すことで、より早く室温に戻すことが可能です（約30分）。また分注することにより、ビーズのコンタミネーションの可能性を減らすことが可能です。
  • 100％ エタノール
  • 小容量Magnetic Separation Device
    • 0.2 mlチューブ用 Magnetic Separation Device（SMARTer-Seq Magnetic Separator - PCR Strip（製品コード 635011））
    • Magnetic Stand-96（Thermo Fisher Scientific社, Code.AM10027）
  • [オプション]96-wellフォーマット磁気ビーズ精製用のデバイス
    • 96-well V-bottom Plate（VWR社, Code. 47743-996）
    • MicroAmp Clean Adhesive Seal（Thermo Fisher Scientific社, Code.4306311）
  • 96-well plate用低速遠心機

その他
  • シングルチャンネルピペット： 10 μl、20 μlおよび200 μl
  • 8連チャンネルピペット： 20 μl、200 μl
  • フィルターピペットチップ： 2 μl、20 μlおよび200 μl
  • 微量遠心機（1.5 ml チューブ用、0.2 mlチューブまたはストリップ用）

関連製品・受託

Unique Dual Index Kits

注意事項
  • 本ページの製品はすべて研究用として販売しております。ヒト、動物への医療、臨床診断用には使用しないようご注意ください。また、食品、化粧品、家庭用品等として使用しないでください。
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