反応用バッファー添付
製品説明
本酵素は、5’-P末端のオリゴヌクレオチドと、3’-OH末端のオリゴヌクレオチドを結合させる酵素である。補酵素としてATPを要求する。分子内ライゲーションによる環化反応、分子間ライゲーションともに起こる。
最小基質はNpNpNOH（3’-OHオリゴマー、受容体）、pNp（5’、3’DPモノマー、供与体）である。ライゲーション効率は受容体、供与体それぞれの塩基に大きく影響される。DNAはRNAよりもかなり効率が悪い。
最小基質はNpNpNOH（3’-OHオリゴマー、受容体）、pNp（5’、3’DPモノマー、供与体）である。ライゲーション効率は受容体、供与体それぞれの塩基に大きく影響される。DNAはRNAよりもかなり効率が悪い。
保存
－20℃
濃度
40 U/μl
形状
| 20 mM | Tris-HCl（pH7.5） |
| 50 mM | NaCl |
| 1 mM | DTT |
| 0.1 mM | EDTA |
| 50% | グリセロール |
添付Buffer組成（10×）
| 500 mM | Tris-HCl（pH7.5） |
| 100 mM | MgCl2 |
| 100 mM | DTT |
| 10 mM | ATP |
| 0.1％ | BSA［別添付］* |
* BSAが沈殿する恐れがあるので、凍結・融解はできるだけ避ける。
活性の定義
Oligo(A)nを基質として、5℃、10分間に1 pmolの[5'-32P]pCpを酸不溶性沈殿物に取り込む酵素活性を1 Uとする（RNA 3'末端標識反応）。
活性測定用反応液組成
| 50 mM | HEPES-NaOH緩衝液（pH7.5） |
| 20 mM | MgCl2 |
| 3.3 mM | DTT |
| 6 μM | ATP |
| 0.001％ | ウシ血清アルブミン |
| 10％ | DMSO |
| 1.2 μM | 3'-OH RNA |
| 2.4 μM | [5'-32P]pCp |
品質管理データ
性能試験結果については、各ロットのCertificate of Analysis（CoA）をご覧ください。CoAはhttps://catalog.takara-bio.co.jp/search/doc_index.phpからダウンロードできます。
使用上の注意
- 分子間ライゲーションの至適反応温度は5～15℃で、それ以上では抑制される。
- PEG共存下で反応は促進されるが、反応特異性に変化はない。
- 10×添付Bufferに0.1％ウシ血清アルブミンを直接加えると多量の白沈が生じるので、反応液を調製する際は次の順番で試薬を加える。
滅菌精製水→10×添付Buffer→0.1％BSA→基質RNA or DNA
用途
- 一本鎖RNAおよび一本鎖DNAの3’-OH末端の標識
- 一本鎖oligo RNA、一本鎖oligo DNAの連結
起源
Escherichia coli carrying the plasmid encoding T4 RNA ligase gene
一般的性質
- 分子量
約47,000 - サブユニット
シングルポリペプチドからなる球状タンパク質 - 至適pH
pH7.2～8.4、（分子間反応）HEPES-NaOH Buffer受容体がDNAオリゴマーの場合 pH8.3（ATP生成系なし） pH7.9（ATP生成系あり） - 補因子
ATP（必須であるが1 mM以上で阻害、ATP：供与体＝3：1程度がよい）
dATPを用いると20％の効率しかない。他のNTPは代用にならない。 - 活性化剤
ヘキサアミンコバルトクロリド（HCC）二価カチオン Mg2＋（至適濃度：20 mM） 受容体がDNAの場合はATP再成系に必要なMn2＋の方がよい。 DMSO 10～20％（40％ DMSOでも活性あり） pCpを用いたRNAの末端ラベルで10％ DMSOは2～3倍の活性化効果がある DNAオリゴマーへのpdNpの付加には効果がないが、10％ DMSOで一本鎖 DNAオリゴマーの連結は促進される。 - 還元剤
DTT（1～20 mM、33 mM DTTでも阻害されない） - 阻害剤
PPi、Pi、NH4＋（基質を脱塩すると効率が上がることがある）
参考
Yeast tRNAphe基質としたとき、上記反応液中で50 Uの本酵素を5℃で16時間作用させると、80％以上のtRNApheの3'末端が標識される。
- 注意事項
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