Cloned
反応用バッファー添付
製品説明
本酵素は、鋳型DNA、プライマー存在下でdNTPを基質とし、鋳型に相補的なDNAを5’→3’方向に合成する酵素である。本酵素は、Klenow Fragmentに比べて、約100～1,000倍強い一本鎖DNA特異的 3’→5’exonuclease活性が含まれているが、5’→3’exonuclease活性は持たない。
保存
－20℃
濃度
2～5 U/μl
形状
| 200 mM | リン酸カリウム緩衝液（pH6.5） |
| 1 mM | DTT |
| 50％ | グリセロール |
添付Buffer組成（10×）
| 330 mM | Tris-acetate（pH7.9） |
| 660 mM | CH3COOK |
| 100 mM | (CH3COO)2Mg |
| 5 mM | DTT |
| 0.1％ | BSA［別添付］ |
活性の定義
活性化ポリ(dA-dT)を鋳型/プライマーとして用い、37℃、pH8.8において、30分間に10 nmolの全ヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む酵素活性を1 Uとする。
活性測定用反応液組成
| 67 mM | Tris-HCl（pH8.8） |
| 6.7 mM | MgCl2 |
| 16.6 mM | (NH4)2SO4 |
| 1 mM | DTT |
| 6.7 μM | EDTA |
| 0.0167％ | ウシ血清アルブミン |
| 7 μg/ml | 活性化ポリ(dA-dT) |
| 各330 μM | dATP、dTTP |
| 8 μCi/ml | [3H]dTTP |
品質管理データ
性能試験結果については、各ロットのCertificate of Analysis（CoA）をご覧ください。CoAはhttps://catalog.takara-bio.co.jp/search/doc_index.phpからダウンロードできます。
使用上の注意
- 活性の発現にMg2＋を要求し、最大活性のためにはSH還元剤を要求する1)。
- 反応系全体のイオン強度が100 mMを超えると阻害される2)。
- 10×添付Bufferに0.1％ウシ血清アルブミンを直接加えると多量の白沈が生じるので、反応液を調製する際は次の順番で試薬を加える。
滅菌精製水→10×添付Buffer→0.1％ BSA→基質DNA
用途
- DNAフラグメント末端の平滑化4)
- 3’→5’exonuclease活性を利用した、replacement synthesisによるDNAフラグメントの3’末端からの標識3, 6)
起源
Escherichia coli carrying the plasmid containing phage T4 DNA polymerase gene
一般的性質
- 分子量
114,000 - サブユニット
単純ポリペプチド
15個のシステイン残基を持ち、活性に必須 - 補因子
Mg2＋ （至適濃度：6 mM）、Mn2＋（至適濃度：0.1 mM、6 mM Mg2＋のときの1/4）、SH試薬（2-メルカプトエタノール、DTT等） - 活性化剤
Polymerase活性は、T4 gene 32産物により特異的に顕著な活性の増大を示すが、exonuclease活性は飽和量のT4 gene 32産物により完全に阻害される。 - 阻害剤
NEM - 安定性
vortex等の激しい撹拌により失活する。 - 至適塩濃度
100 mM（高すぎると阻害、200 mMで50 mMの5％） - polymerase活性とexonuclease活性の関係
次の3つの条件が揃うとpolymerase活性を示す。
1．鋳型
2．鋳型より少なくとも1塩基は短い3'-OH末端のプライマー
3．鋳型に相補的なdNTP
このうち1つでも欠けるとexonucleaseとして働く。
- 注意事項
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