PCR、LA PCR™、Hot Start PCR について

PCR（Polymerase Chain Reaction）法とは、

　・DNA鎖の熱変性（denaturation step）
　・プライマーのアニーリング（annealing step）
　・ポリメラーゼによる相補鎖の合成（extension step）

を繰り返し行うことによりin vitroでDNAを増幅する方法である（図1参照）。この方法を用いると、DNAを数時間で少なくとも10⁵倍に増幅できる。TaKaRa Taq（製品コード R001）は、Thermus aquaticus YT-1株よりDNA Polymerase遺伝子をクローニングし、この遺伝子を導入した組換え体大腸菌を用いて大量発現し、高度に精製した94 kDaの耐熱性DNAポリメラーゼで、天然のTaq DNA Polymeraseと同じ機能を持っている。


図1 PCRによるDNA増幅の工程

ステップ1：プライマー、dNTP、ポリメラーゼを含んだ反応液中で、目的とする二本鎖DNA断片を熱変性する（例えば、94℃、30 sec.）
ステップ2：熱変性により生じた一本鎖鋳型DNAにプライマーをアニーリングする（例えば、55℃、30 sec.）
ステップ3：DNAポリメラーゼを用いて相補鎖DNAを合成する（例えば、72℃、1 min./kb）
ステップ4：増幅産物としての二本鎖DNAを再度熱変性して一本鎖にする（ステップ1に戻る）
ステップ1～4を1サイクルとして、25～30サイクル繰り返す。ただし、目的DNA断片により、増幅の最大効率を得る条件が異なるので、目的DNA断片に応じて設定条件を変更する必要がある。

PCR法は、分子生物学のみならず、医学を始め生物学全体に広く浸透し、加えて法医学、食品、環境衛生検査、動植物検査等の分野で、簡便迅速な方法として汎用されている。PCR法に使用されるポリメラーゼとしては、Taq DNA Polymeraseが一般的であるが、Taq DNA Polymeraseを用いたPCR法には以下のような限界もある。

1. 正確性（Fidelity）
   Taq DNA Polymeraseは、一般的にfidelityがあまり高くないといわれ、PCR中のmisincorporationが問題になる場合もあり、PCRクローニング、変異導入等の際、注意が必要とされている。
2. 増幅鎖長
   Taq DNA Polymeraseを用いたPCRでは、通常、数kbのDNAを増幅し、10 kbを超える増幅は困難だといわれている。これは、特にマッピング等のゲノム解析にPCR法を導入する際の障害となっている。

また、クローニング等PCR以降の実験や、感度を要求する食品環境衛生検査等において、増幅量を多くすることは非常に重要なことである。
タカラバイオは、これらの限界を解決すべく、ポリメラーゼ/バッファー/反応条件を総合的に検討することで、正確性を改善するとともに、40 kbのDNAも効率よく増幅できるLA PCR（Long and Accurate PCR）テクノロジーを開発した。このLA PCRテクノロジーは、PCRの応用分野をさらに拡大するもので、今後ゲノム解析、遺伝子診断、長鎖フラグメントのクローニングおよび変異導入等、さまざまな利用が期待できる。

LA PCRの鍵となるのは酵素である。TaKaRa Ex Taq、TaKaRa LA Taqは3’→5’エキソヌクレアーゼ活性（proof reading活性）を含む耐熱性DNAポリメラーゼである。まちがった塩基が取り込まれると、それ以後の反応性が極端に悪くなる。これを3'→5'エキソヌクレアーゼ活性により取り除いて反応をスムーズに進めることにより、結果的に長鎖DNAの増幅が可能となる（図2）。


図2 LA PCRの原理

Hot Start PCR法は、サイクル前のミスプライミングやプライマーダイマーに由来する非特異的増幅を防ぎ、目的断片の増幅効率を高める有効な方法である。TaKaRa Taq Hot Start Version 、TaKaRa Ex Taq Hot Start Version、TaKaRa LA Taq Hot Start Versionには、抗Taq抗体と結合させた Hot Start 用のPCR酵素を使用しており、最初の熱変性(ステップ1)で抗体が変性し酵素から外れるまで、ポリメラーゼ活性が抑制される。


図3 Hot Start PCRの原理

3人の実験者がそれぞれ、TaKaRa Ex TaqおよびTaKaRa Ex Taq Hot Start Versionを使用して同じ条件でPCRを実施した。 反応液の調製は室温で行った（各コンポーネントは氷上）。