total RNA 100 ng～1 μgからイルミナ社NGS用ライブラリーを迅速に調製
- イルミナ社次世代シーケンサー用の方向性情報を持ったライブラリー調製キット
- 対象生物種はヒト、マウス、ラット、Input total RNA量は100 ng～1 μg
- RIN（RNA Integrity Number）値3～10のRNAから高品質で信頼性の高いデータを取得
- 95%以上の割合で方向性情報を正確に維持
- 5時間の迅速プロトコールで、最大96インデックスの設定が可能
- リボソームRNA除去からライブラリー調製まで
製品説明
SMARTer Stranded Total RNA Sample Prep Kit - HI Mammalianは、100 ng～1 μgのヒト、マウス、ラットのtotal RNAからインデックスを付加したイルミナ社シーケンサー用ライブラリーを迅速に調製するキットである。RiboGone技術とSMART技術を組み合わせた一連の操作により、約5時間でリボソームRNA（rRNA）除去とstrand-specific RNA-Seqライブラリーの調製を行うことができる。
RiboGone技術により、ライブラリー調製前にtotal RNAの90％近くを占めているrRNAを効果的に除去することで、シーケンスコストを下げ、マッピングの精度（mapping statistics）を上げることができる。連続したSMART技術によって、strand情報を維持しながら、逆転写反応、PCR増幅と同時にインデックス配列を付加することができ、ライブラリー調製の手間を大幅に軽減できる。
本製品には12種類のReverseプライマーと8種類までのForwardプライマー＊が含まれていてハイスループット解析にも対応でき、最大96インデックスが設定可能である。
なお、インプットRNA量が少ない場合（100 pg～100 ng）は、SMARTer Stranded Total RNA Sample Prep Kit - Low Input Mammalianの使用を推奨する。
＊製品に含まれるForwardプライマーの数はキットによって異なる。
12回用（製品コード 634873）、24回用（製品コード 634874）には1種類、48回用（製品コード 634875）には4種類、96回用（製品コード 634876）、192回用（製品コード 634877）、480回用（製品コード 634878）には8種類のForwardプライマーが含まれている。
RiboGone技術により、ライブラリー調製前にtotal RNAの90％近くを占めているrRNAを効果的に除去することで、シーケンスコストを下げ、マッピングの精度（mapping statistics）を上げることができる。連続したSMART技術によって、strand情報を維持しながら、逆転写反応、PCR増幅と同時にインデックス配列を付加することができ、ライブラリー調製の手間を大幅に軽減できる。
本製品には12種類のReverseプライマーと8種類までのForwardプライマー＊が含まれていてハイスループット解析にも対応でき、最大96インデックスが設定可能である。
なお、インプットRNA量が少ない場合（100 pg～100 ng）は、SMARTer Stranded Total RNA Sample Prep Kit - Low Input Mammalianの使用を推奨する。
＊製品に含まれるForwardプライマーの数はキットによって異なる。
12回用（製品コード 634873）、24回用（製品コード 634874）には1種類、48回用（製品コード 634875）には4種類、96回用（製品コード 634876）、192回用（製品コード 634877）、480回用（製品コード 634878）には8種類のForwardプライマーが含まれている。
図1．実験フローチャート
A：RiboGone技術によりtotal RNAからrRNAを除去
B：SMART技術により両末端に付加配列を持つ1st-strand cDNAを合成
C：PCRにより5'-、3'-両末端にIlluminaインデックス配列を持つRNA-Seqライブラリーを作製
表1．RIN値が異なるRNAから調製したライブラリーの評価
化学的にRIN 3またはRIN 7まで剪断したマウス肝臓RNAから本キットを用いてライブラリーを調製し、マッピングを行った。解析データはrRNA、exon領域、intron領域、intergenic領域にマッピングされたリード数の比率（％）で示した。また、Picard解析により正しいstrandを同定した。
図2．データの再現性
各100 ngの Human Universal Reference RNA（HURR；Agilent）2サンプルよりRNA-seqライブラリーを調製し、各ライブラリーのFPKMs（Fragments Per Kilobase Of Exon Per Million Fragments Mapped）の相関性を調べた。
表2．Reference RNAのアライメント
Human Universal Reference RNA（HURR；Agilent）、およびHuman Brain Reference RNA（HBRR；Ambion）各400 ngにERCC Spike-In RNAを添加してライブラリーを作製し、アライメントを行った。アライメントデータはrRNA、exon領域、intron領域、intergenic領域にマッピングされたリード数の比率（％）で示した。また、Picard解析により正しいstrandを同定した。
図3．RINが異なるRNA間の相関性テスト
化学的にRIN 3またはRIN 7まで剪断したマウス肝臓RNA各1 μgからライブラリーを調製し、各ライブラリーのFPKMs（Fragments Per Kilobase Of Exon Per Million Fragments Mapped）の相関性を調べた。
図4．RNA-seqデータとMAQCデータの相関性
SMARTer Stranded Total RNA Sample Prep Kit - HI Mammalianを用いて各400 ng のHuman Universal Reference RNA（HURR）、およびHuman Brain Reference RNA（HBRR）からライブラリーを作製し、同じreference RNAを使用したMAQC（MicroArray Quality Control）qPCRデータとの相関性を調べた。
図5．RNA-seqデータのダイナミックレンジと直線性
Human Brain Reference RNA（HBRR）にERCC Spike-In RNA MIX2を添加してライブラリーを作製した。ERCC濃度と発現解析結果（FPKM）は高い相関性を示した。
内容
Package 1
Package 2
SeqAmp DNA Polymerase（製品コード 638504、または638509）
Indexing Primer Set HT for Illumina
・Control Mouse Liver Total RNA（1 μg/μl）
・SMARTer Stranded Oligonucleotide（12 μM）
・SMARTer Stranded Oligonucleotide（12 μM）
Package 2
・10X Total RNA Hyb Buffer
・RNase Inhibitor（40 U/μl）
・RNase H
・10X RNase H Buffer
・DNase I（5 U/μl）
・Nuclease-Free Water
・10X Total RNA First-Strand Buffer
・PrimeScript Reverse Transcriptase（200 U/μl）
・Stranded Elution Buffer
・RNase Inhibitor（40 U/μl）
・RNase H
・10X RNase H Buffer
・DNase I（5 U/μl）
・Nuclease-Free Water
・10X Total RNA First-Strand Buffer
・PrimeScript Reverse Transcriptase（200 U/μl）
・Stranded Elution Buffer
SeqAmp DNA Polymerase（製品コード 638504、または638509）
・SeqAmp DNA Polymerase
・SeqAmp PCR Buffer (2X)
・SeqAmp PCR Buffer (2X)
Indexing Primer Set HT for Illumina
Indexing Primer Set HT for Illumina-12
・Forward PCR Primer HT Index 2（F2；12.5 μM）
・Reverse PCR Primer HT Index 1～12（R1～R12；12.5 μM）
・・・ 12回用（製品コード 634873）、24回用（製品コード 634874）に添付
Indexing Primer Set HT for Illumina - 48 A
・Forward PCR Primer HT Index 1～4（F1～4；12.5 μM）
・Reverse PCR Primer HT Index 1～12（R1～R12；12.5 μM）
・・・ 48回用（製品コード 634875）に添付
Indexing Primer Set HT for Illumina
・Forward PCR Primer HT Index 1～8（F1～8；12.5 μM）
・Reverse PCR Primer HT Index 1～12（R1～R12；12.5 μM）
・・・ 96回用（製品コード 634876）、192回用（製品コード 634877）、480回用（製品コード 634878）に添付
・Forward PCR Primer HT Index 2（F2；12.5 μM）
・Reverse PCR Primer HT Index 1～12（R1～R12；12.5 μM）
・・・ 12回用（製品コード 634873）、24回用（製品コード 634874）に添付
Indexing Primer Set HT for Illumina - 48 A
・Forward PCR Primer HT Index 1～4（F1～4；12.5 μM）
・Reverse PCR Primer HT Index 1～12（R1～R12；12.5 μM）
・・・ 48回用（製品コード 634875）に添付
Indexing Primer Set HT for Illumina
・Forward PCR Primer HT Index 1～8（F1～8；12.5 μM）
・Reverse PCR Primer HT Index 1～12（R1～R12；12.5 μM）
・・・ 96回用（製品コード 634876）、192回用（製品コード 634877）、480回用（製品コード 634878）に添付
保存
SMARTer Stranded Total RNA Sample Prep Kit - HI Mammalian
Package 1：－70℃
Package 2：－20℃
Indexing Primer Set HT for Illumina：－20℃
2X SeqAmp DNA Polymerase：－20℃
Package 1：－70℃
Package 2：－20℃
Indexing Primer Set HT for Illumina：－20℃
2X SeqAmp DNA Polymerase：－20℃
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