SMARTer® Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian

微量FFPEサンプルからもRNA-Seqが可能
  • ヒト、マウス、ラットの微量（250 pg～）のtotal RNAからRNA-Seq解析が可能
  • FFPEやLCM由来の分解を受けたRNAやcell-free RNAを含むすべての品質のRNAから信頼性の高い結果を取得
  • シーケンス結果の改良 ― PhiXを添加しなくても高いクラスターpassing filter（％ PF）が得られる
  • すべての工程が6時間で完了する迅速プロトコール
  • PCRバッファーの改良により、ライブラリー精製の効率がアップ
  • 最大96インデックスの設定が可能なイルミナ社NGS装置対応のライブラリー作製
製品コード メーカー
略称		 製品名 容量 価格（税別） 特記事項 説明書、CoA
データシート
ベクター情報		 参考資料 カート
Takara Code
634411

CLN

Clontech
 SMARTer® Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian
取寄 ライセンス
12回 ￥241,000
 説明書・データシート・ベクター情報 個
Z4411N
634412

CLN

Clontech
 SMARTer® Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian
ライセンス
48回 ￥850,000
 説明書・データシート・ベクター情報 個
Z4412N
634413

CLN

Clontech
 SMARTer® Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian
取寄 ライセンス
96回 ￥1,129,000
 在庫に限りのある製品の為、数量と納期はご相談下さい。 説明書・データシート・ベクター情報 個
Z4413N
634414

CLN

Clontech
 SMARTer® Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian
ライセンス
192回 ￥2,039,000
 在庫に限りのある製品の為、数量と納期はご相談下さい。 説明書・データシート・ベクター情報 個
Z4414N
カートにいれる

WEB会員ログインが必要です

製品説明

SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2- Pico Input Mammalianは、250 pg～10 ngのヒト、マウス、ラットtotal RNAからイルミナ社シーケンサー用ライブラリーを効率よく作製するキットである。本キットは、高品質のRNAはもちろん、FFPEやLCMサンプルから調製された分解の進んだ低品質RNAでも使用することができる。インデックスとアダプターを付加したstrand-specific RNA-Seqライブラリーを、逆転写反応、PCR増幅のステップも含めた一連の操作により作製できる。
従来品に比べてv2キットは、イルミナ社シーケンサーにおけるシーケンスのパフォーマンスを改良する工夫がされており、また、より使いやすいライブラリー精製のワークフローになっている。
total RNA中に含まれるリボソームRNA（rRNA）（および一部ミトコンドリアRNA）は、rRNA特異的プローブを使用した独自技術を採用することにより、効率的に除かれる。その結果、シーケンスコストを下げ、マッピング精度（mapping statistics）を上げることができる。
v2キットで作製されたライブラリーは従来のキットで作製されたライブラリーとは異なる設計になっており、イルミナ社のNGS装置を使用する際、大量のPhiXを添加しなくても高いClusters passing filter（% PF）を得ることができる。その結果、シーケンスの1ランあたり、より生物学的に有意義なリードを得ることができるので、シーケンスコストを下げることができる。v2キットを用いたデータはrRNAやmtRNAにマッピングされるリードが少なく、duplicateの割合も低いため、よりユニークなtranscriptsを識別する傾向がある。さらにv2キットはPCR Bufferの組成を改良したことにより、ライブラリー精製の効率が増大した。

本キットには、12、48、96および192回用の製品があり、96回用および192回用（製品コード 634413、634414）の製品には12種類のReverseプライマーと8種類のForwardプライマーが含まれており、ハイスループット解析用に最大96インデックスが設定できる。

また、本キットにはインデックスプライマーが含まれているが、インデックスホッピング低減のためのユニークデュアルインデックスキット（別売）も使用可能である。

図1. 実験フローチャート
SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalianを用いて作製された最終ライブラリーの構造
図2. SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalianを用いて作製された最終ライブラリーの構造

5' PCR Primer HTおよび3' PCR Primer HTにより付加されたアダプターは、イルミナ社シーケンサーのフローセルへの結合部位（P7、P5）およびイルミナ社 TruSeq HT Index（Index 1 [i5]、Index 2 [i7]）の配列を含んでおり、シーケンスプライマーRead 2およびRead 1を認識する領域も含んでいる。
Read 1では元のRNAのアンチセンス側の配列が得られ、Read 2では元のRNAのセンス側の配列が得られる（元のRNAの方向は 5’→3’になる）。
Read 2を用いた場合の最初の3塩基 (XXX)はPico v2 SMART Adapter由来の配列になるので、paired-end sequencingを行った場合、この3塩基はマッピングの前にトリミングする必要がある。

SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalianによるpassing-filter rate（％ PF）の改善
図3. SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalianによるpassing-filter rate（％ PF）の改善

従来のキット（Pico v1）と本キット（Pico v2）を用いて作製したライブラリーを、NextSeq 500またはMiniSeqを用いてシーケンスを行った。それぞれのグラフにおいて、青い枠の部分はunfiltered (raw) リードのクラスター密度の分布を示している。一方、緑の枠の部分はfilteringを行ったリードのクラスター密度の分布を示している。
Passing filterのリード数（M：million）と%PFの値をグラフの上に表記した。
イルミナ社の規格では、予想されるPassing filterのリード数は、NextSeqの場合は130 M、MiniSeqの場合は25 Mである。PhiXはPico v2キットでは1％、Pico v1キットでは10％添加している。
Pico v2キットの場合、PhiXにアライメントされたリードの割合はすべてのシーケンスランにおいて、0.5％から1.15％の間である。
上記のグラフの結果により、Pico v2キットで作製されたライブラリーは、Pico v1キットに比べて高い% PFの値が得られた。

SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalianによる感度と再現性の改善
図4. SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalianによる感度と再現性の改善

1 ngまたは10 ngのヒト肺FFPE組織から抽出したTotal RNAから、従来のキット（Pico v1）および Pico v2キットを用いてライブラリーを調製し、NextSeq 500でシーケンスを行った。
Panel A：1 ngおよび10 ng inputから調製したライブラリーの評価
どちらのinput量においてもPico v2を用いた場合、ライブラリーの収量が多く、rRNAやmtRNAにマッピングされるリード数の割合や、Duplicateの割合が低かった。1 ngのinputではPico v2のライブラリーから得られたシーケンスデータでは、Pico v1の場合に比べて数千以上多くのTranscript数が得られ、Pico v2では高い感度での解析が可能になった。
Panel B : 1 ngおよび10 ng inputから調製したライブラリーのFPKMs（Fragments Per Kilobase of Exon Per Million Fragments Mapped）の相関性
Pico v2キットを用いた場合、Pico v1キットに比べて1 ngと10 ngのinputのデータにおいて高い再現性が見られた。FPKMの値はlog10 scaleで表示している。

内容

Package 1:
SMART TSO Mix v2
R-Probes v2
Control Total RNA (1 μg/μl)

Package 2
ZapR v2
SMART Pico Oligos Mix v2
5X First-Strand Buffer
SMARTScribe RT (100 U/μl)
RNase Inhibitor (40 U/μl)
10X ZapR Buffer
SeqAmp DNA Polymerase
SeqAmp CB PCR Buffer (2X):
Tris Buffer (5 mM)
PCR2 Primers v2
Nuclease-Free Water

Indexing Primer Set:
12回用（製品コード 634411）
Indexing Primer Set HT for Illumina v2-12
3’ PCR Primer HT Index 2 (3’ 2; 12.5 μM)
5’ PCR Primer HT Index 1～12 (5’ 1～12; 12.5 μM)

48回用（製品コード 634412）
Indexing Primer Set HT for Illumina v2- 48
3’ PCR Primer HT Index 1～4 (3’ 1～4 ; 12.5 μM)
5’ PCR Primer HT Index 1～12 (5’ 1～12; 12.5 μM)

96回用（製品コード 634413）、192回用（製品コード 634414）
Indexing Primer Set HT for Illumina v2-96（192回用は2個含まれる。）
3’ PCR Primer HT Index 1～8 (3’ 1～8; 12.5 μM)
5’ PCR Primer HT Index 1～12 (5’ 1～12; 12.5 μM)

保存

Package 1：－70℃
Package 2：－20℃
Indexing Primer Set：－20℃

本製品以外に必要な試薬、機器（主なもの）

下記の製品は本キット中に含まれません。下記の製品はユーザーマニュアルに記載のProtocolで使用できることが確認されています。他製品では代替はできないため、ご注意ください。
  • シングルチャンネルピペット：10 μl、20 μlおよび200 μl
  • 8連チャンネルピペット： 20 μl、200 μl
  • Pre-PCR amplification用のPCRサーマルサイクラー
  • PCR amplification用のPCRサーマルサイクラー
    （Final RNA-seq Library Amplificationのステップを100μlの反応液でPCRを行うため、100μlの反応液量に対応したPCRサーマルサイクラーを使用する。50μlの反応液量に対応したサーマルサイクラーの場合は、2本のチューブにわけてPCRを行う。）
  • フィルターピペットチップ： 10 μl、20 μlおよび200 μl
  • 0.2 ml tube minicentrifuge
  • 96-well PCR chiller rack: IsoFreeze PCR Rack (MIDSCI社 Code 5640-T4) or 96 Well Aluminum Block（Light Labs社 Code A-7079）

PCR増幅およびバリデーション
  • Agilent High Sensitivity DNA Kit（Agilent社 Code 5067-4626）
  • Qubit dsDNA HS kit（Thermo Fisher Scientific社 Code Q32851）
  • Nuclease-free thin-wall PCR tube（USA Scientific社；0.2 ml Code 1402-4700）
  • Nuclease-free nonsticky 1.5 ml tubes (USA Scientific社 Code 1415-2600)

SPRI Bead精製
  • Agencourt AMPure XP PCR Purification Kit（Beckman Coulter社; 5 ml, Code A63880、60 ml, Code A63881）
  • 0.2 ml チューブ用Magnetic Separation Device（Magnetic Separator - PCR Strip：製品コード 635011）
  • 80％ Ethanol（用時調製）

Technical Notes

Improved ease of use and sequencing performance for whole transcriptome analysis of high-quality or degraded samples
Stranded NGS libraries from FFPE samples
RNA-seqを成功させるためのコツ（英語）
ヒト生体液および細胞外小胞からのtotal RNA-seq（英語）
RNA-seqのヒント（英語）
無細胞核酸のシーケンス解析（英語）
Total RNA-seqの概要（英語）
SMARTer® Stranded Total RNA-Seq Kit v2 Pico Input Mammalianを用いたRNAバイオマーカー探索（英語）

使用文献・参考文献

関連製品・受託

SMARTer® Stranded Total RNA-Seq Kit - Pico Input Mammalian
SMARTer-Seq™ Magnetic Separator - PCR Strip

注意事項
  • 本ページの製品はすべて研究用として販売しております。ヒト、動物への医療、臨床診断用には使用しないようご注意ください。また、食品、化粧品、家庭用品等として使用しないでください。
  • タカラバイオの承認を得ずに製品の再販・譲渡、再販・譲渡のための改変、商用製品の製造に使用することは禁止されています。
  • タカラバイオ製品に関連するライセンス・パテントについては、ライセンスマークをクリックして内容をご確認ください。
    また、他メーカーの製品に関するライセンス・パテントについては、各メーカーのウェブサイトまたはメーカー発行のカタログ等でご確認ください。
  • ウェブサイトに掲載している会社名および商品名などは、各社の商号、または登録済みもしくは未登録の商標であり、これらは各所有者に帰属します。