SMARTer^® Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit

SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kitは、5'RACE法とNGSテクノロジーを組み合わせることにより、RNAサンプルから、ヒトBCRプロファイリングの高感度で正確かつ最適化されたアプローチを提供する。5'RACE法の採用によりバイアスを減らし、BCRのH鎖またはL鎖の定常領域からのプライミングを可能にする。本キットは、遺伝子特異的増幅におけるこれらの利点を組み合わせて、BCR転写産物のV（D）J可変領域全体をキャプチャーし、高感度で再現性の高いB細胞レパトア解析を可能にする。
本キットは、末梢血単核細胞（PBMC）から10 ng～1 μgのtotal RNAまたはB細胞から1～100 ngのtotal RNAから高品質のイルミナ社次世代シーケンサー用ライブラリーを調製し、ヒト免疫グロブリンIgGおよびIgMのH鎖およびL鎖（κ鎖、λ鎖）の両方のデータが得られる。このプロファイリングキットには、分子バーコード（UMI）が含まれており、PCRエラー、duplicateやシーケンスエラーに由来するリードを除去できるため、より正確で信頼性の高い結果が得られる。

Panel A.　SMARTScribe Reverse Transcriptase による1st strand cDNA合成を行い、mRNAの5'末端に達するとテンプレートに依存しないヌクレオチドが付加される。
SMART UMI Oligoは、この付加されたヌクレオチドにアニーリングし、逆転写反応によってヌクレオチドの追加配列をfirst stranded cDNAに組み込むためのテンプレートとして機能する。（これがtemplate switching ステップに相当する）。次に、1 st strand cDNAを用いて2段階の遺伝子特異的PCR増幅を行う。（Panel Bの詳細を参照）。nested PCRの2 nd PCRの産物は、大部分のリードがB細胞受容体転写物にマッピングされる。

Panel B.　1st PCRは1st strand cDNAをテンプレートにして、イルミナの Read 2 Primer配列と相補的なフォワードプライマー（PCR1 Universal Forward primer）とBCRの H鎖またはL鎖の定常領域（非可変領域）に相補的なリバースプライマー（PCR1 IgG/IgM/IgK/IgL Reverse primer）で行う。
Read 2 Primer配列と定常領域から増幅することにより、1st PCRではBCRのH鎖またはL鎖のcDNAの可変領域全体と大部分の定常領域を特異的に増幅する。2nd PCRは 1st PCRの産物をテンプレートにして、semi-nested プライマー（PCR2 IgG/IgM/IgK/IgL Reverse primer）を使用してBCRのH鎖またはL鎖のcDNAの可変領域全体と定常領域の部分を増幅する。

1 ng、10 ng、および100 ngのヒトCD19^＋B細胞由来total RNAから本製品を用いてBCRプロファイリングIgG、IgM、IgK、およびIgLライブラリーを作製した。1 ng、10 ng、100 ngのRNAインプットのライブラリーに対して、各々100,000リード、400,000リード、5,000,000リードにダウンサンプリングして解析した。インプットRNA量が増えるとクロノタイプカウントが増加し、RNA量が少なく複雑性の高いサンプルでも安定したデータが取得された。

健常人ドナーからのPBMC由来のRNA 1μgからIgG、IgM、IgK、およびIgLのライブラリーを2連で作製した。ライブラリーは13Mリードにダウンサンプリングして解析された。プロットには、複製した4つのライブラリー（IgG、IgM、IgK、およびIgL）がすべて含まれている。1 μgのPBMC RNAを用いて行った場合、ピアソン相関係数は0.98、スピアマン相関係数は0.72になり高い再現性を示した。

8人のドナー（異なる色で表示）からのPBMC RNAの各10 ngからSMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kitを使用してIgG、IgM、IgK、およびIgLクロノタイプを決定した。解析はすべて100,000リードにノーマライズされた。クロノタイプカウントはサンプルによって異なるが、本キットを使用すれば様々なクロノタイプが検出された。

SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kitを使用して単一ドナーからのPBMC RNA10 ngからBCR Profilingライブラリーを調製した。

Panel A.　異なるシーケンスdepthでのIgGクロノタイプカウントを、UMIベースのエラー補正あり（青線）となし（紫線）で示した。 IgGおよびその他の鎖（IgM、IgK、およびIgLは未掲載）をライブラリーごとに150万リードで配列決定し、100万、500K、200K、100K、50K、10K、および5Kリードにダウンサンプリングし、さまざまなシーケンスdepthで解析を行った。UMIを用いることで、正確性の高いクロノタイプを検出した。

Panel B.　100K（低depth）および1,500K（高depth）のライブラリー間で重複したクロノタイプを示した。

Package 1：－70℃
Package 2，package 3：－20℃
　　　BCR Enhancer, Nuclease-Free Water：－20℃保存。一度融解した後は4℃保存
　　　Elution Buffer: －20℃保存。一度融解した後は室温保存。
　　　その他：－20℃

下記の製品は本キット中に含まれません。下記の製品はユーザーマニュアルに記載のProtocolで使用できることが確認されています。他製品では代替はできないため、ご注意ください。

• シングルチャンネルピペット： 10 μl、20 μlおよび200 μl
• 8連チャンネルピペット： 20 μl、200 μl
• フィルターピペットチップ： 10 μl、20 μlおよび200 μl
• 微量遠心機 (1.5 ml チューブ用、0.2 mlチューブまたはストリップ用)

PCR増幅およびバリデーション

• 1st strand cDNA合成用のPCRサーマルサイクラー
• PCR amplification用のPCRサーマルサイクラー
• High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (Advanced Analytical, Cat. No. DNF-474)
• Agilent 2100 Bioanalyzer: DNA 1000 Kit (Agilent, Cat. No. 5067-1504)
• Nuclease-free thin-wall PCR tube（0.2 ml；USA Scientific社 Code 1402-4700）
• Nuclease-free-low adhesion1.5 ml tubes (USA Scientific社 Code 1415-2600) またはLoBond tubes (Eppendorf, No.022431021)

SPRI Bead精製

• Agencourt AMPure XP PCR Purification Kit（5 ml; Beckman Coulter社; 5 ml, Code. A63880、60 ml, Code. A63881）
• 0.2 ml チューブ用Magnetic Separation Device (Magnetic Separator-PCR Strip ：製品コード 635011) など
• 100％ Ethanol