SMARTer^® Stranded Total RNA-Seq Kit v3 - Pico Input Mammalian

SMARTer Stranded Total RNA - Seq Kit v3 - Pico Input Mammalianは、250 pg～10 ngのヒト、マウス、ラットtotal RNA、または10～1,000細胞からイルミナ社シーケンサー用ライブラリーを効率よく作製するキットである。高品質のRNAはもちろん、FFPEやLCMサンプルから調製された分解の進んだ低品質RNA^＊も使用することができる（* 低品質RNAの場合は500 pg～10 ng）。
逆転写およびPCR増幅ステップでインデックスとアダプターを組み込むシームレスなワークフローにより、Strand情報を保持したライブラリーが作製できる。total RNA中に含まれるリボソームRNA（rRNA）（および一部ミトコンドリアRNA）は、rRNA特異的プローブを使用した独自技術によって、効率的に除去される。
v3では、個別の分子バーコード（Unique Molecular Identifier : UMI）を付加することにより、PCR増幅バイアスによる影響とシーケンスエラーが軽減され、より正確で信頼性の高いNGS解析が可能である。ライブラリー調製、精製を含む全ての操作が7.5時間で終了し、イルミナ社の全てのプラットフォームでのシーケンスのパフォーマンスが向上している。
本キットには、SMARTer RNA Unique Dual Index Kit - 24U（製品コード 634451）が含まれている。更に、別売のSMARTer RNA Unique Dual Index Kit-96U Set A（製品コード 634452）、Set B（製品コード 634457）と組み合わせて使用することもでき、最大192の異なるインデックスの組み合わせでライブラリー構築が可能である。
なお、10～100 ngのtotal RNAにはSMARTer Stranded Total RNA Sample Prep Kit - Low Input Mammalian、100 ng～1 μgのtotal RNAにはSMARTer Stranded Total RNA Sample Prep Kit - HI Mammalianの使用を推奨する。

図1. 実験フローチャート


図2. SMARTer Stranded Total RNA - Seq Kit v3 - Pico Input Mammalianを用いて作製された最終ライブラリーの構造
SMARTer RNA Unique Dual Index Kit - 24Uにより付加されたアダプターには、イルミナ社シーケンサーのフローセルへの結合部位（P7、P5）およびイルミナ社 TruSeq HT Index（Index 1 [i5]、Index 2 [i7]）の配列を含んでおり、シーケンスプライマーRead 2およびRead 1を認識する領域も含んでいる。Read 1では元のRNAのアンチセンス側の配列が得られ、Read 2では元のRNAのセンス側の配列が得られる（元のRNAの方向は 5’→3’になる）。
Read 2を用いた場合の最初の8塩基はUMIで、その下流にPico v3 SMART UMI Adapter由来の3塩基（XXX）が続く。

SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v3 - Pico Input Mammalian Components

Package 1

・SMART UMI-TSO Mix v3
・R-Probes v3
・Control Total RNA (1 μg/μl)

Package 2

・ZapR v3
・SMART Pico Oligos Mix v3
・5X First-Strand Buffer
・SMARTScribe II Reverse Transcriptase
・ZapR Buffer (10X)
・RNase Inhibitor (40 U/μl)
・SeqAmp DNA Polymerase
・SeqAmp CB PCR Buffer (2X)
・PCR2 Primers v3
・Nuclease-Free Water
・Tris Buffer (5 mM)
・10X Lysis Buffer

SMARTer RNA Unique Dual Index Kit - 24U（製品コード 634451）

・U25～U48 - SMARTer RNA Unique Dual Index (各12.5 μM)

SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v3 - Pico Input Mammalian Components
　Package 1：－70℃
　Package 2：－20℃

SMARTer RNA Unique Dual Index Kit - 24U（製品コード 634451）：－20℃

下記の製品は本キット中に含まれません。下記の製品はユーザーマニュアルに記載のProtocolで使用できることが確認されています。他製品では代替はできないため、ご注意ください。

・UDI Primer（25以上のサンプルをプールする場合に使用）
　SMARTer RNA Unique Dual Index Kit - 96U Set A（製品コード 634452）
　SMARTer RNA Unique Dual Index Kit - 96U Set B（製品コード 634457）
・シングルチャンネルピペット：10 μl、20 μlおよび200 μl
・8連チャンネルピペット： 20 μl、200 μl
・Pre-PCR amplification用のPCRサーマルサイクラー
・PCR amplification用のPCRサーマルサイクラー
（Final RNA-seq Library Amplificationのステップを100 μlの反応液でPCRを行うため、100 μlの反応液量に対応したPCRサーマルサイクラーを使用する。50 μlの反応液量に対応したサーマルサイクラーの場合は、2本のチューブにわけてPCRを行う。）
・フィルターピペットチップ：10 μl、20 μlおよび200 μl
・0.2 ml tube minicentrifuge
・96-well PCR chiller rack: IsoFreeze PCR Rack（MIDSCI社 Code 5640-T4） or 96 Well Aluminum Block（Light Labs社 Code A-7079）

PCR増幅およびバリデーション

・Agilent High Sensitivity DNA Kit（Agilent社 Code 5067-4626）
・Qubit dsDNA HS kit（Thermo Fisher Scientific社 Code Q32851）
・Nuclease-free thin-wall PCR tube 0.2 ml（USA Scientific社 Code 1402-4700）
・Nuclease-free nonsticky 1.5 ml tubes（USA Scientific社 Code 1415-2600）

Bead精製

・NucleoMag NGS Clean-up and Size Select（製品コード 744970.5／.50／.500）
・0.2 ml チューブ用Magnetic Separation Device（Magnetic Separator - PCR Strip：製品コード 635011）
・80％ Ethanol（用時調製）