UMI付き、微量total RNA（250 pg～10 ng）から方向性情報を持ったNGS用ライブラリー調製が可能
- ヒト、マウス、ラットの微量（250 pg～10 ng）のtotal RNA、または10～1,000個の細胞からRNA-Seq解析が可能
- UMI（分子バーコード）により、PCR増幅バイアスの影響とシーケンスエラーが軽減され、より正確なNGS解析が可能
- FFPEやLCM由来の分解を受けたRNAやcell-free RNAを含むすべての品質のRNAから信頼性の高い結果を取得
- バッファーの改良により、6.5時間で方向性情報を保持したRNA-Seqライブラリーを調製可能
- rRNA除去試薬の改良により、効果的にrRNAのリードを除去
- Unique Dual Index Kit（製品コード 634752～634756）と組み合わせることにより、最大384サンプルのマルチプレックス解析に対応可能
注：SMART-Seq Total RNA Pico Input with UMIs (ZapR Mammalian)は、SMARTer Stranded Total RNA - Seq Kit v3 - Pico Input Mammalian（製品コード 634485～634488）のリニューアル製品で、rRNA除去試薬の性能が向上しています（図8参照）。既存製品とは異なりインデックスが別売りとなっていますので、必ず別途ご購入ください。（Unique Dual Index Kit参照）
新製品と既存製品の対応表はこちら（TB USA社のサイト）
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※本キットにはIndexが含まれていません。Unique Dual Index Kit（製品コード 634752/634753/634754/634755/634756）を別途ご購入ください。
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製品説明
SMART-Seq Total RNA Pico Input with UMIs (ZapR Mammalian) は、250 pg～10 ngのヒト、マウス、ラットのtotal RNAまたは10～1,000個のインタクトな細胞から、イルミナ社次世代シーケンサー対応のライブラリーを調製するキットです。高品質のRNAはもちろん、FFPEやLCMサンプルから調製された分解の進んだ低品質RNA＊も使用することができます（* 低品質RNAの場合は500 pg～10 ng）。本キットは、SMART（Switching Mechanism at 5' End of RNA Template）テクノロジーを用いており、逆転写およびPCR増幅ステップでインデックスとアダプターを組み込むシームレスなワークフローにより、Strand情報を保持したライブラリーを調製できます。更に、逆転写ステップで8塩基の個別の分子バーコード（Unique Molecular Identifier：UMI）も付加されるため、PCR増幅バイアスによる影響とシーケンスエラーが軽減され、より正確で信頼性の高いNGS解析が可能となります。
本キットのワークフローにはrRNA特異的プローブを使用した独自技術によってrRNA（および一部ミトコンドリアRNA）由来のcDNAを除去する工程が含まれているため、別途リボゾームRNA除去試薬を用意する必要はなく、rRNAへのマッピングが低い再現性の高いデータが得られます。
ライブラリー調製、精製を含む全ての操作は6.5時間で終了し、別売りのUnique Dual Index Kit（製品コード 634752～634756）と組み合わせることにより、最大384サンプルのマルチプレックス解析に対応可能です。
本キットのワークフローにはrRNA特異的プローブを使用した独自技術によってrRNA（および一部ミトコンドリアRNA）由来のcDNAを除去する工程が含まれているため、別途リボゾームRNA除去試薬を用意する必要はなく、rRNAへのマッピングが低い再現性の高いデータが得られます。
ライブラリー調製、精製を含む全ての操作は6.5時間で終了し、別売りのUnique Dual Index Kit（製品コード 634752～634756）と組み合わせることにより、最大384サンプルのマルチプレックス解析に対応可能です。
図1. 実験フローチャート
図2. SMART-Seq Total RNA Pico Input with UMIs (ZapR Mammalian) を用いて調製された最終ライブラリーの構造
Unique Dual Index Kit（製品コード 634752～634756）を用いて付加された配列には、イルミナ社シーケンサーのフローセルでクラスタリングできる配列（P7、P5、Index 1 [i7]、Index 2 [i5]）と、シーケンスプライマーRead 2およびRead 1を認識する領域が含まれている。Read 1では元のRNAのアンチセンス側の配列が得られ、Read 2では元のRNAのセンス側の配列が得られる。Read 2の最初の8塩基はUMIで、その下流にUMIリンカー3塩基（NNN）とSMART UMI Adapter由来の3塩基（XXX）が続く。paired-end sequencingを行った場合、SMART UMI Adapter由来の3塩基（XXX）をマッピングの前にトリミングする必要がある。
Unique Dual Index Kit（製品コード 634752～634756）を用いて付加された配列には、イルミナ社シーケンサーのフローセルでクラスタリングできる配列（P7、P5、Index 1 [i7]、Index 2 [i5]）と、シーケンスプライマーRead 2およびRead 1を認識する領域が含まれている。Read 1では元のRNAのアンチセンス側の配列が得られ、Read 2では元のRNAのセンス側の配列が得られる。Read 2の最初の8塩基はUMIで、その下流にUMIリンカー3塩基（NNN）とSMART UMI Adapter由来の3塩基（XXX）が続く。paired-end sequencingを行った場合、SMART UMI Adapter由来の3塩基（XXX）をマッピングの前にトリミングする必要がある。
図3. 異なるRNAインプット量から調製したライブラリーのrRNA由来cDNA除去効果と遺伝子数、トランスクリプト数の評価
SMART-Seq Total RNA Pico Input with UMIsを用いて、250 pgおよび10 ngのヒト脳total RNAからライブラリーを調製後、キットに含まれるZapR Mammalian rRNA Depletion KitによるrRNA由来cDNA除去処理（ZapR treatment）を実施したものと実施しないもので比較した。ZapR treatmentしたものはPCR増幅による濃縮後、ZapR treatmentしないものはそのままシーケンスに使用した。それぞれのライブラリーについて3×106ペアエンドリードをCogentAPで解析し、その結果を棒グラフ（パネルA）と表（パネルB）に示した。
250 pg 、10 ngのいずれのインプット量でも、ZapR treatmentしたライブラリーのrRNA readsの割合は10％以下となっており、幅広いレンジでrRNA由来cDNAが効率よく除去されることが示された。また、ZapR treatmentしたライブラリーでは、遺伝子数、トランスクリプト数が増加した。
SMART-Seq Total RNA Pico Input with UMIsを用いて、250 pgおよび10 ngのヒト脳total RNAからライブラリーを調製後、キットに含まれるZapR Mammalian rRNA Depletion KitによるrRNA由来cDNA除去処理（ZapR treatment）を実施したものと実施しないもので比較した。ZapR treatmentしたものはPCR増幅による濃縮後、ZapR treatmentしないものはそのままシーケンスに使用した。それぞれのライブラリーについて3×106ペアエンドリードをCogentAPで解析し、その結果を棒グラフ（パネルA）と表（パネルB）に示した。
250 pg 、10 ngのいずれのインプット量でも、ZapR treatmentしたライブラリーのrRNA readsの割合は10％以下となっており、幅広いレンジでrRNA由来cDNAが効率よく除去されることが示された。また、ZapR treatmentしたライブラリーでは、遺伝子数、トランスクリプト数が増加した。
図4. インプット量の異なるサンプル間での相関性
SMART-Seq Total RNA Pico Input with UMIs (ZapR Mammalian) を用いてヒト脳total RNA 250 pgおよび10 ngからRNA-Seqライブラリーを調製し、それぞれのライブラリーについて、3×106ペアエンドリードをCogentAPで解析して相関性を調べた。その結果、インプット量250 pgと10 ngの間で高い相関性が得られた。
SMART-Seq Total RNA Pico Input with UMIs (ZapR Mammalian) を用いてヒト脳total RNA 250 pgおよび10 ngからRNA-Seqライブラリーを調製し、それぞれのライブラリーについて、3×106ペアエンドリードをCogentAPで解析して相関性を調べた。その結果、インプット量250 pgと10 ngの間で高い相関性が得られた。
図5. ヒト初代B細胞から調製したtotal RNA-Seqライブラリーの遺伝子数とトランスクリプト数
SMART-Seq Total RNA Pico Input with UMIsを用いて、ヒト初代B細胞のtotal RNA 1 ngからライブラリーを調製後、キットに含まれるZapR Mammalian rRNA Depletion KitによるrRNA由来cDNA除去処理（ZapR treatment）を実施したものと実施しないもので比較した。ZapR treatmentしたものはPCR増幅による濃縮後、ZapR treatmentしないものはそのままシーケンスに使用した。それぞれのライブラリーについて、3×106ペアエンドリードをCogentAPで解析し、その結果を棒グラフ（パネルA）と表（パネルB）に示した。
その結果、ZapR treatmentしたライブラリーのrRNA readsの割合は10％以下となっており、rRNA由来cDNAが効率よく除去されることが示された。また、ZapR treatmentしたライブラリーでは、遺伝子数、トランスクリプト数が増加した。
SMART-Seq Total RNA Pico Input with UMIsを用いて、ヒト初代B細胞のtotal RNA 1 ngからライブラリーを調製後、キットに含まれるZapR Mammalian rRNA Depletion KitによるrRNA由来cDNA除去処理（ZapR treatment）を実施したものと実施しないもので比較した。ZapR treatmentしたものはPCR増幅による濃縮後、ZapR treatmentしないものはそのままシーケンスに使用した。それぞれのライブラリーについて、3×106ペアエンドリードをCogentAPで解析し、その結果を棒グラフ（パネルA）と表（パネルB）に示した。
その結果、ZapR treatmentしたライブラリーのrRNA readsの割合は10％以下となっており、rRNA由来cDNAが効率よく除去されることが示された。また、ZapR treatmentしたライブラリーでは、遺伝子数、トランスクリプト数が増加した。
図6. ヒト初代B細胞から調製したライブラリーのレプリケート間での比較
SMART-Seq Total RNA Pico Input with UMIs (ZapR Mammalian) を用いて、1 ngのヒト初代B細胞のtotal RNAからduplicateでライブラリーを調製し、3×106ペアエンドリードをCogentAPで解析して相関性を調べた。その結果、レプリケート間で高い相関性が示された。
SMART-Seq Total RNA Pico Input with UMIs (ZapR Mammalian) を用いて、1 ngのヒト初代B細胞のtotal RNAからduplicateでライブラリーを調製し、3×106ペアエンドリードをCogentAPで解析して相関性を調べた。その結果、レプリケート間で高い相関性が示された。
図7. 分解を受けたFFPE RNAサンプルから調製されたライブラリーの評価
SMART-Seq Total RNA Pico Input with UMIs (ZapR Mammalian) を用いて、10 ngのFFPE RNA（RIN＝3、DV200＝77％）からduplicateでライブラリーを調製し、3×106ペアエンドリードをCogentAPで解析し、その結果を棒グラフ（パネルA）と表（パネルB）に示した。その結果、分解を受けたサンプルからでもレプリケート間で高い再現性が示された。
SMART-Seq Total RNA Pico Input with UMIs (ZapR Mammalian) を用いて、10 ngのFFPE RNA（RIN＝3、DV200＝77％）からduplicateでライブラリーを調製し、3×106ペアエンドリードをCogentAPで解析し、その結果を棒グラフ（パネルA）と表（パネルB）に示した。その結果、分解を受けたサンプルからでもレプリケート間で高い再現性が示された。
図8. rRNA除去試薬の新／既存製品比較
SMART-Seq Total RNA Pico Input with UMIs（新製品）を用いて、250 ngのヒト脳total RNAからライブラリーを調製後、キットに含まれるZapR Mammalian rRNA Depletion KitによるrRNA由来cDNA除去処理（ZapR treatment）を実施し、PCR増幅により濃縮した。コントロールとしてZapR treatmentしていないライブラリーをそのまま用いた（No depletion）。更に、SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v3 - Pico Input Mammalian（既存製品）を用いて、250 ngのヒト脳RNAからライブラリーを調製した。
それぞれのライブラリーについて、3×106ペアエンドリードをCogentAPで解析し、リード分布を比較した。
ZapR Mammalian rRNA Depletion Kitで処理したライブラリーのリード分布は、SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v3 - Pico Input Mammalianで調製したライブラリーと比較したところ、rRNAのリードの割合が減少してExonのリードの割合が増加し、rRNA除去試薬の性能向上が示された。
SMART-Seq Total RNA Pico Input with UMIs（新製品）を用いて、250 ngのヒト脳total RNAからライブラリーを調製後、キットに含まれるZapR Mammalian rRNA Depletion KitによるrRNA由来cDNA除去処理（ZapR treatment）を実施し、PCR増幅により濃縮した。コントロールとしてZapR treatmentしていないライブラリーをそのまま用いた（No depletion）。更に、SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v3 - Pico Input Mammalian（既存製品）を用いて、250 ngのヒト脳RNAからライブラリーを調製した。
それぞれのライブラリーについて、3×106ペアエンドリードをCogentAPで解析し、リード分布を比較した。
ZapR Mammalian rRNA Depletion Kitで処理したライブラリーのリード分布は、SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v3 - Pico Input Mammalianで調製したライブラリーと比較したところ、rRNAのリードの割合が減少してExonのリードの割合が増加し、rRNA除去試薬の性能向上が示された。
図9. マウス脳total RNA-Seq ライブラリーのrRNA除去効率と遺伝子数、およびトランスクリプト数
SMART-Seq Total RNA Pico Input with UMIsを用いて、250 ngのマウス脳total RNAからライブラリーを調製後、キットに含まれるZapR Mammalian rRNA Depletion KitによるrRNA由来cDNA除去処理（ZapR treatment）を実施したものと実施しないもので比較した。ZapR treatmentしたものはPCR増幅による濃縮後、ZapR treatmentしないものはそのままシーケンスに使用した。それぞれのライブラリーについて、3×106ペアエンドリードをCogentAPで解析し、リード分布（パネルAとパネルC）と遺伝子数（パネルBとパネルC）を示した。
その結果、ZapR treatmentしたライブラリーでは、遺伝子数が増加した。
SMART-Seq Total RNA Pico Input with UMIsを用いて、250 ngのマウス脳total RNAからライブラリーを調製後、キットに含まれるZapR Mammalian rRNA Depletion KitによるrRNA由来cDNA除去処理（ZapR treatment）を実施したものと実施しないもので比較した。ZapR treatmentしたものはPCR増幅による濃縮後、ZapR treatmentしないものはそのままシーケンスに使用した。それぞれのライブラリーについて、3×106ペアエンドリードをCogentAPで解析し、リード分布（パネルAとパネルC）と遺伝子数（パネルBとパネルC）を示した。
その結果、ZapR treatmentしたライブラリーでは、遺伝子数が増加した。
内容
SMART-Seq Total RNA Pico Input with UMIs (ZapR Mammalian)（製品コード 634354/634355/634356）
- SMART-Seq Total RNA Pico Input with UMIs＊
Package 1
・SMART UMI-TSO Mix v3
Package 2
・SMART Pico Oligos Mix v3
・5X First-Strand Buffer
・SMARTScribe II Reverse Transcriptase
・RNase Inhibitor (40 U/µl)
・SeqAmp DNA Polymerase
・SeqAmp CB PCR Buffer (2X)
・Tris Buffer (5 mM)
・PCR2 Primers v3
・Nuclease-Free Water
・10X Lysis Buffer
- ZapR Mammalian rRNA Depletion Kit＊
Package 1
・R-Probes
・Control Total RNA (1 µg/µl)
Package 2
・ZapR Enzyme
・ZapR Buffer (10X)
保存
- SMART-Seq Total RNA Pico Input with UMIs
- Package 1：－70℃
- Package 2：－20℃
- ZapR Mammalian rRNA Depletion Kit
- Package 1：－70℃
- Package 2：－20℃
本製品以外に必要な試薬、器具、機器（主なもの）
下記の製品は本キット中に含まれません。下記の製品はユーザーマニュアルに記載のProtocolで使用できることが確認されています。
Index Kit
- Unique Dual Index Kit (1-24)（製品コード 634756）
UDI No. U001-U024 - Unique Dual Index Kit (1-96)（製品コード 634752）
UDI No, U001-U096 - Unique Dual Index Kit (97-192)（製品コード 634753）
UDI No, U097-U192 - Unique Dual Index Kit (193-288)（製品コード 634754）
UDI No, U193-U288 - Unique Dual Index Kit (289-384)（製品コード 634755）
UDI No, U289-U384
サンプル調製（セルソーティング）
- 8-tube strips（Thermo Fisher Scientific社, Cat. No. AB0264）またはセルソーティングに適したPCR tube strips、96 well plates
- （オプション）BD FACS Pre-Sort Buffer（BD社 Cat. No. 563503）
- Microplate film（USA Scientific社, Cat. No. 2920-0010）for sealing tubes/plates before sorting
- Aluminum single tab foil seal（USA Scientific社, Cat. No. 2938-4100）または cap strips（Thermo Fisher Scientific社, Cat. No. AB0784/AB0850）for sealing tubes/plates after sorting
- ドライアイス（細胞の凍結用）
- （オプション）SMART-Seq HT Kit Lysis Components（製品コード 634439）または10× Lysis Buffer（製品コード 635013）
cDNA合成、PCR増幅
- PCRサーマルサイクラー 2台（cDNA合成用、PCR増幅用）
- Nuclease-free, PCR-grade, thin-wall PCR strips（0.2 ml PCR 8-tube strip; USA Scientific社, Cat. No.1402-4700）または同様のPCR-grade, thin-wall PCR tubes, strips、96-well plates
- Nuclease-free, low-adhesion 1.5 ml tubes（USA Scientific社, Cat. No. 1415-2600）、DNA LoBind tubes（Eppendorf社, Cat. No. 022431021）または同様の核酸低吸着性チューブ
- Thermo Scientific Adhesive PCR Plate Seals（Thermo Fisher Scientific社, Cat. No. AB0558）for 96-well plates or cap strips（Thermo Fisher Scientific社, Cat. No. AB0784/AB0850）for 8-tube strips
Beads精製
- NucleoMag NGS Clean-up and Size Select（5 ml size：製品コード 744970.5；50 ml size：製品コード 744970.50；500 ml size：製品コード 744970.500）
※NucleoMagの代わりにAMPure XP PCR purification kit（Beckman Coulter社 5 ml size：Cat. No. A63880；60 ml size：Cat. No. A63881）も使用可能 - 80％エタノール（用時調製）
- Magnetic Separation Device
- 24～96サンプルの場合：Magnetic Stand 96（Thermo Fisher Scientific社 Cat. No. AM10027）、V-bottom plates（500 μl; VWR, Cat. No. 47743-996）、adhesive PCR Plate Seals（Thermo Fisher Scientific社, Cat. No. AB0558）と組み合わせて使用
- 1.5 mlチューブ（ライブラリーのプール用）の場合：Magnetic Stand (2 tubes)（製品コード 631964）、8-tube strips（Thermo Fisher Scientific社, Cat. No. AB0264）、またはnuclease-free, PCR-grade, thin-wall PCR tubes、strips、96-well plates
cDNA定量、ライブラリー定量（必要に応じて選択）
- High Sensitivity DNA Kit（Agilent Technologies社, Cat. No. 5067-4626）、High Sensitivity D5000 ScreenTape（Agilent Technologies社, Cat. No. 5067-5592）、または同等の高感度電気泳動法
- Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit（Thermo Fisher Scientific社, Cat. No. P11496）または Qubit dsDNA HS Assay Kit（Thermo Fisher Scientific社, Cat. No. Q32851 or Q32854）
- Library Quantification Kit（製品コード 638324）
その他
- シングルチャンネルピペット：10 μl、20 μlおよび200 μl
- 8連、あるいは12連チャンネルピペット：10 μl
- フィルターピペットチップ：10 μl、20 μl、および200 μl
- 1.5 mlチューブ用微量遠心機
- 0.2 mlチューブまたはstrip用微量遠心機
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- 注意事項
- 本ページの製品はすべて研究用として販売しております。ヒト、動物への医療、臨床診断用には使用しないようご注意ください。また、食品、化粧品、家庭用品等として使用しないでください。
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