“Mate & Plate™”ライブラリー作製システム

酵母ツーハイブリッドスクリーニングのためには、Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System（製品コード 630489）が必要です。

Make Your Own “Mate & Plate” Library Systemを用いれば、これまで多くの時間と労力が必要であった酵母ツーハイブリッドスクリーニングのためのcDNAライブラリー作製を1週間以内に完了することができる。
酵母形質転換済みのMate & Plateライブラリーシリーズに研究目的に適したライブラリーがない場合は、本システムを用いてY187酵母株にオリジナルのライブラリーを構築する。1回のライブラリー作製により100回以上の酵母ツーハイブリッドスクリーニングが可能になる。本システムでは、SMART法によりcDNA合成を行う。また、ライブラリーの構築は、酵母が持つ非常に効率的な相同組換え反応を利用し、Y187株内で直接行われる（図1）。相同組換えを利用することで、従来法の大腸菌の形質転換やライブラリー増幅の必要がなく、簡便、迅速にライブラリーを構築できる。


図1. 酵母内での相同組換えを利用したライブラリー構築概要
Mate & Plateライブラリーは、SMART法により合成したcDNAとMatchmaker Gold SystemのpreyプラスミドpGADT7-Rec間での相同組換えを利用して構築される。

Clontechが特許を有するSMART法は、Moloney murine leukemia virus（MMLV）逆転写酵素に本来備わっているターミナルトランスフェラーゼ活性と、ターミナルスイッチング活性に基づく画期的なcDNA合成方法である。
まず、SMART Oligo(dT) 、またはランダムプライマーにより1st strand cDNA合成を行い、逆転写酵素が鋳型となるmRNAの5’末端に達すると、ターミナルトランスフェラーゼ活性により合成したcDNA鎖の末端にシトシンリッチな短い配列が自動的に付加される。次に、3’側に相補的な配列を持つSMART Oligoがこのシトシンリッチな配列にハイブリダイズし、逆転写酵素のための鋳型を延長する。逆転写酵素はターミナルスイッチング活性により鋳型を切替え、SMART Oligoの末端までcDNA合成を続けるため、合成されたcDNAの両末端は既知のユニバーサルプライマー結合配列を持つことになる（図2）。この結果、容易にcDNAのPCR増幅が可能であり、100 ngのtotal RNAからでもライブラリーを作製することができる。
このSMART法を用いたMake Your Own "Mate & Plate" Library Systemでは、合成されたcDNA（SMART cDNA）の末端が、Matchmaker Gold SystemのpreyプラスミドpGADT7-Recの末端と相同配列を持つようにデザインされているため、酵母Y187株にpGADT7-RecとSMART cDNAをコトランスフォームすることで、酵母内での相同組換えを利用したライブラリー作製を行うことができる。


図2. SMART法の概要

Box 1：
・SMART MMLV RT
・5× First-Strand Buffer
・100 mM DTT
・CDS III Primer (12 μM)
・CDS III/6 Primer (10 μM)
・RNase H (2 units/μl)
・5' PCR Primer (10 μM)
・3' PCR Primer (10 μM)
・Melting Solution
・SV40 Large T PCR Fragment
・dNTP Mix (10 mM each dNTP)
・pGADT7-Rec AD Cloning Vector(Sma I-linearized)
Box 2：
Yeastmaker Yeast Transformation System 2
・Yeastmaker Carrier DNA, denatured (10 mg/ml)
・pGBT9 Control Plasmid
Box 3：
Yeastmaker Yeast Transformation System 2
・50% PEG
・1 M LiAc (10×)
・10× TE Buffer
・YPD Plus Liquid Medium
Box 4：
・SMART III Oligonucleotide (12 μM)
・Control Poly A^＋ RNA
・S. cerevisiae Y187
Box 5：
・1 pouch YPDA Broth (0.5 L)
・1 pouch YPDA with Agar (0.5 L)
・1 pouch SD/-Leu with Agar (0.5 L)
・NaCl Solution (0.9%)
・Sodium Acetate (3 M)
・Deionized H₂O
・CHROMA SPIN+TE-400 Columns

Box 1、2：－20℃
Box 4：－70℃
Box 3、5：室温