- 分裂細胞では一過性に、非分裂細胞では安定的に目的遺伝子を発現するインテグラーゼ欠損型レンチウイルスを産生
- 宿主細胞ゲノムへの組込みなしで、ウイルス挿入によるゲノム変異のリスクを軽減
- 広範な宿主に適応するVSV-Gエンベロープ
- 高力価のレンチウイルスを作製可能
- 簡便操作が可能なプレミックスタイプのシングルショットをご用意
製品選択ガイド（English）
製品説明
レンチウイルスベクターは遺伝子導入のための強力なツールであり、効果的なトランスフェクションの手法として、分裂細胞や静止細胞において広く利用されている。多くの市販のレンチウイルスパッケージングシステムは、プロウイルスとして宿主細胞のゲノムに組み込まれるレンチウイルスを産生する。本製品は、プロウイルスのゲノムへの組込みを最小となるようにインテグラーゼに変異を入れることにより、ゲノム非組込み型のレンチウイルスを作製することができる。インテグラーゼ欠損型レンチウイルス（IDLV）は宿主細胞内で環状エピソームとして存在する。このエピソームは分裂細胞内では次第に希釈され、欠失していく（一過性発現）が、静止細胞内では安定である。IDLVを使用することで、インテグラーゼ活性型レンチウイルスの場合と比べ、ウイルス挿入による変異リスクが大幅に低減できる。
Lenti-X Packaging Single Shots(Integrase Deficient)は、簡便にワンステップで高タイターのIDLVを作製できるシングルショットタイプのレンチウイルスパッケージングミックスである。
5種類のプラスミドを最適な割合で混合したプラスミドミックスを用いており、Leｎti-X 293T細胞にトランスフェクションすることによって高タイターのIDLVを作成できる。 シングルショットの場合、目的遺伝子を搭載したレンチウイルスベクタープラスミドの水溶液を加えて混合、静置後、10 cmディッシュ中のLenti-X 293T Cells（製品コード 632180）などの293T細胞培養に加えるだけでIDLVの作製が可能である。
図1. インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターを用いた、非分裂分化細胞での蛍光タンパク質の長期発現
インテグラーゼ欠損型レンチウイルスベクターシステムとpLVX-ZsGreen1とLenti-X 293T細胞を用いて、レンチウイルスベクターを作製した。ウイルス上清を回収し、フローサイトメトリーにより定量した。正常ヒト神経前駆細胞を6日間分化させ、インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターをMOI=80で感染させ、その後2週間ZsGreen1の発現を検出した。
図に見られるように、これらの非分裂細胞でこの期間中に顕著な減少なしに蛍光タンパク質の発現は継続した。
図2. 各パッケージングシステムのコンポーネント
Clontechのインテグラーゼ欠損型第4世代Lenti-X Packaging Single Shotsは、5種類の異なるコンポーネントを含み（パネルC）、高いパッケージング性能を発揮するように最適な割合で混合されている。インテグラーゼの変異は、導入されたウイルスのゲノムへの組込み効率を減少させるため、分裂細胞では導入タンパク質の発現は一過性となる。また、gag、pol、env遺伝子の分離は、効率的にRCL(replication competent lentivirus)の出現の可能性を減少させることができる。(Wu et al. 2000; Mol. Ther. 2:47–55)。
ウイルス必須コンポーネントの高レベルの発現が一連のTat転写因子とTet-Offによりコントロールされ、結果として、高力価レンチウイルスを産生できる。Polタンパク質の組換えレンチウイルス粒子への移行を確実にするために、pol遺伝子とvpr遺伝子は融合されている。
一方、力価の低い第三世代のレンチウイルスパッケージングシステム(パネルB)は、gagとpol遺伝子を分離しておらず、Tet転写因子、Tet-Offによる転写調節システムも利用していない。
図3. インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターによる分裂細胞での一過性発現
通常型、またはインテグラーゼ欠損型ZsGreen1発現レンチウイルスベクターを、通常型のベクターシステムとインテグラーゼ欠損型ベクターシステムを用いて作製した。それぞれのウイルス力価をqRT-PCRとフローサイトメトリー法(IFU)により比較した。MOI=20のウイルス量をHT1080細胞に感染させ、ZsGreen1を発現している細胞の割合をフローサイトメトリーにより測定した。分裂細胞で実験期間中、発現を維持している通常型のレンチウイルスベクターと比べ、インテグラーゼ欠損型レンチウイルスベクターでは、10日後の発現はバックグラウンドのレベル近くまで低下し、一過性の発現パターンを示した。
図4. インテグラーゼ欠損型レンチウイルスベクターは高い発現能力を持つエピソームを形成する
RNAウイルスベクターの細胞への導入により、末端にLTRをもつ線状二本鎖DNAが逆転写により作られる。その後dsDNAは核に移行する。通常、ゲノムへの組込みが行われないDNAは線状もしくは環状の両方の状態で存在し、どちらも導入遺伝子を発現する。線状DNAは、インテクラーゼによりゲノムDNAへ組込まれ、安定したプロウイルスを形成する。環状のものはNHEJ経路もしくは相同組換えにより形成される。変異型（不活性型）インテグラーゼを含むインテグラーゼ欠損型ベクターシステムでは、環状エピソームがより多く存在し、目的遺伝子を発現する。これらのエピソームはその後、分裂細胞では細胞分裂により次第に失われるが、静止細胞では維持される。
Lenti-X Packaging Single Shots(Integrase Deficient)は、簡便にワンステップで高タイターのIDLVを作製できるシングルショットタイプのレンチウイルスパッケージングミックスである。
5種類のプラスミドを最適な割合で混合したプラスミドミックスを用いており、Leｎti-X 293T細胞にトランスフェクションすることによって高タイターのIDLVを作成できる。 シングルショットの場合、目的遺伝子を搭載したレンチウイルスベクタープラスミドの水溶液を加えて混合、静置後、10 cmディッシュ中のLenti-X 293T Cells（製品コード 632180）などの293T細胞培養に加えるだけでIDLVの作製が可能である。
図1. インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターを用いた、非分裂分化細胞での蛍光タンパク質の長期発現
インテグラーゼ欠損型レンチウイルスベクターシステムとpLVX-ZsGreen1とLenti-X 293T細胞を用いて、レンチウイルスベクターを作製した。ウイルス上清を回収し、フローサイトメトリーにより定量した。正常ヒト神経前駆細胞を6日間分化させ、インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターをMOI=80で感染させ、その後2週間ZsGreen1の発現を検出した。
図に見られるように、これらの非分裂細胞でこの期間中に顕著な減少なしに蛍光タンパク質の発現は継続した。
図2. 各パッケージングシステムのコンポーネント
Clontechのインテグラーゼ欠損型第4世代Lenti-X Packaging Single Shotsは、5種類の異なるコンポーネントを含み（パネルC）、高いパッケージング性能を発揮するように最適な割合で混合されている。インテグラーゼの変異は、導入されたウイルスのゲノムへの組込み効率を減少させるため、分裂細胞では導入タンパク質の発現は一過性となる。また、gag、pol、env遺伝子の分離は、効率的にRCL(replication competent lentivirus)の出現の可能性を減少させることができる。(Wu et al. 2000; Mol. Ther. 2:47–55)。
ウイルス必須コンポーネントの高レベルの発現が一連のTat転写因子とTet-Offによりコントロールされ、結果として、高力価レンチウイルスを産生できる。Polタンパク質の組換えレンチウイルス粒子への移行を確実にするために、pol遺伝子とvpr遺伝子は融合されている。
一方、力価の低い第三世代のレンチウイルスパッケージングシステム(パネルB)は、gagとpol遺伝子を分離しておらず、Tet転写因子、Tet-Offによる転写調節システムも利用していない。
図3. インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターによる分裂細胞での一過性発現
通常型、またはインテグラーゼ欠損型ZsGreen1発現レンチウイルスベクターを、通常型のベクターシステムとインテグラーゼ欠損型ベクターシステムを用いて作製した。それぞれのウイルス力価をqRT-PCRとフローサイトメトリー法(IFU)により比較した。MOI=20のウイルス量をHT1080細胞に感染させ、ZsGreen1を発現している細胞の割合をフローサイトメトリーにより測定した。分裂細胞で実験期間中、発現を維持している通常型のレンチウイルスベクターと比べ、インテグラーゼ欠損型レンチウイルスベクターでは、10日後の発現はバックグラウンドのレベル近くまで低下し、一過性の発現パターンを示した。
図4. インテグラーゼ欠損型レンチウイルスベクターは高い発現能力を持つエピソームを形成する
RNAウイルスベクターの細胞への導入により、末端にLTRをもつ線状二本鎖DNAが逆転写により作られる。その後dsDNAは核に移行する。通常、ゲノムへの組込みが行われないDNAは線状もしくは環状の両方の状態で存在し、どちらも導入遺伝子を発現する。線状DNAは、インテクラーゼによりゲノムDNAへ組込まれ、安定したプロウイルスを形成する。環状のものはNHEJ経路もしくは相同組換えにより形成される。変異型（不活性型）インテグラーゼを含むインテグラーゼ欠損型ベクターシステムでは、環状エピソームがより多く存在し、目的遺伝子を発現する。これらのエピソームはその後、分裂細胞では細胞分裂により次第に失われるが、静止細胞では維持される。
内容
Lenit-X Packaging Single Shots（Integrase Deficient）(製品コード 631277)
・Lenit-X Packaging Single Shots（Integrase Deficient） 16回分
＊ Single Shot 1本で10 cmディッシュ1枚のパッケージングに使用可能
・Lenit-X Packaging Single Shots（Integrase Deficient） 16回分
＊ Single Shot 1本で10 cmディッシュ1枚のパッケージングに使用可能
保存
－20℃
- 注意事項
- 本ページの製品はすべて研究用として販売しております。ヒト、動物への医療、臨床診断用には使用しないようご注意ください。また、食品、化粧品、家庭用品等として使用しないでください。
- タカラバイオの承認を得ずに製品の再販・譲渡、再販・譲渡のための改変、商用製品の製造に使用することは禁止されています。
- タカラバイオ製品に関連するライセンス・パテントについては、ライセンスマークをクリックして内容をご確認ください。
また、他メーカーの製品に関するライセンス・パテントについては、各メーカーのウェブサイトまたはメーカー発行のカタログ等でご確認ください。 - ウェブサイトに掲載している会社名および商品名などは、各社の商号、または登録済みもしくは未登録の商標であり、これらは各所有者に帰属します。
