正確さが要求される増幅に
反応用バッファー添付＋dNTP
製品説明
本製品は、Pyrococcus sp.由来の3'→5' exonuclease活性（proof reading 活性）を有する耐熱性α型DNAポリメラーゼである。Pyrococcus furiosus由来のPfu DNAポリメラーゼや、Vent DNAポリメラーゼと同等の正確性の高い増幅を行うことができ、しかもTaq DNAポリメラーゼと同程度の増幅効率がある。また、TaKaRa TaqなどのTaq DNAポリメラーゼとは異なり、hot start法を用いなくても非特異的増幅が抑えられるのも特長である。
内容
（125 U）
| Pyrobest DNA Polymerase | 125 U |
| 10×Pyrobest Buffer II (10 mM Mg2+ plus） | 500 μl |
| dNTP Mixture | 400 μl |
保存
－20℃
形状
| 50 mM | Tris-HCl （pH8.2） |
| 0.1 mM | EDTA |
| 1 mM | DTT |
| 0.1％ | Tween 20 |
| 0.1％ | NP-40 |
| 50％ | Glycerol |
添付dNTP Mixture*
| 濃度 | 各2.5 mM |
| 形状 | 水溶液（ナトリウム塩）pH7～9 |
| 純度 | 各98％以上 |
* dATP、dCTP、dGTP、dTTPの等モル混合物で、希釈せずにそのままPCR反応に用いることができる。
活性の定義
活性化サケ精子DNAを鋳型／プライマーとして用い、下記の活性測定用反応液中にて74℃において、30分間に10 nmolの全ヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性を1 Uとする。
活性測定用反応液組成
| 20 mM | Tris-HCl 緩衝液 （pH8.3, 37℃） |
| 10 mM | KCl |
| 6 mM | (NH4)2SO4 |
| 2 mM | MgCl2 |
| 0.1％ | Triton X-100 |
| 0.001％ | BSA |
| 各 200 μM | dATP・dGTP・dCTP |
| 100 μM | ［3H］TTP |
| 0.4 mg/ml | 活性化サケ精子 DNA |
純度
●10 Uの本酵素と0.6 μgのλ-Hind III分解物を74℃、1時間反応させてもDNAの電気泳動パターンに変化は起こらない。
●10 Uの本酵素と0.6 μgのsupercoiled pBR322 DNAを74℃、1時間反応させてもDNAの電気泳動パターンに変化は起こらない。
●10 Uの本酵素と0.6 μgのλDNAを74℃、1時間反応させてもDNAの電気泳動パターンに変化は起こらない。
●10 Uの本酵素と0.6 μgのsupercoiled pBR322 DNAを74℃、1時間反応させてもDNAの電気泳動パターンに変化は起こらない。
●10 Uの本酵素と0.6 μgのλDNAを74℃、1時間反応させてもDNAの電気泳動パターンに変化は起こらない。
一般的なPCR反応液組成（Total 50 μl）
| Pyrobest DNA Polymerase（5 U/μl） | 0.25 μl |
| 10×Pyrobest Buffer II | 5 μl |
| dNTP Mixture（各2.5 mM） | 4 μl |
| Template | ＜500 ng |
| Primer 1 | 0.2～1.0 μM （final conc.） |
| Primer 2 | 0.2～1.0 μM （final conc.） |
| 滅菌精製水 | up to 50 μl |
PCR条件 （例）
1 kb DNA を増幅する場合
または
（注意）
・基本的には2ステップPCRをお勧めします。プライマーのTm値が低く、2ステップPCRが難しい場合には、3ステップPCRをお試しください。
・変性の条件は、使用機種とチューブの種類にあわせて設定してください。変性時間の設定の目安は、94℃の場合は20 sec～30 sec、98℃の場合は1sec～10sec です。
| 98℃、10 sec 68℃、1 min |
30 cycles |
| 98℃、10 sec 55℃、30 sec 72℃、1 min |
30 cycles |
（注意）
・基本的には2ステップPCRをお勧めします。プライマーのTm値が低く、2ステップPCRが難しい場合には、3ステップPCRをお試しください。
・変性の条件は、使用機種とチューブの種類にあわせて設定してください。変性時間の設定の目安は、94℃の場合は20 sec～30 sec、98℃の場合は1sec～10sec です。
PCR産物について
Pyrobest DNA polymeraseを用いて増幅したPCR産物の多くは平滑末端である。したがって、そのPCR産物をそのまま(必要に応じてリン酸化して)平滑末端のベクターにクローニングすることが可能である。
PCR 検定
●大腸菌ゲノムDNAを鋳型としたPCR反応（増幅産物8 kb）において良好な増幅が見られることを確認している。
●ヒトゲノムDNAを鋳型としたsingle copy gene（p53遺伝子）のPCR反応（増幅産物2.9 kb）において良好な増幅が見られることを確認している。
●ヒトゲノムDNAを鋳型としたsingle copy gene（p53遺伝子）のPCR反応（増幅産物2.9 kb）において良好な増幅が見られることを確認している。
用途
Polymerase Chain Reaction（PCR）法によるDNA増幅、特に正確性が要求されるPCRに最適。
使用上の注意
イノシンを含むプライマーの使用は避けてください。
補足資料
Application
Pyrobest™ DNA Polymerase、TaKaRa Taq™、C社Cloned PfuおよびC社改良Cloned Pfuの比較（λDNAの増幅）
Pyrobest™ DNA Polymerase、TaKaRa Taq™およびA社Hot start用Taqの比較
Pyrobest™ DNA Polymeraseを用いた増幅例
Human p53 region 2.9 kbの増幅反応
大腸菌8 kbの増幅反応
大腸菌2 kbの増幅反応での感度
- 注意事項
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