HAT™ タンパク質発現＆精製システム

HAT Protein Expression & Purification System（特許出願中）を用いれば、タンパク質の発現と精製を効率よく簡単に行える。HATベクターには新規のポリヒスチジンエピトープタグがコードされており、大腸菌で発現させたタグ融合目的タンパク質を、中性pH／生理的pHの穏やかな条件下で精製できる。HAT (histidine affinity tag) は天然に存在するポリヒスチジンペプチドタグで、インクルージョンボディーを形成しにくい特長を示す。また、本タグは6×Hisより長く（表1）、高分子量の目的タンパク質と融合発現した場合、高分子量タンパク質構造の外側に位置する可能性が高いため、高分子タンパク質の発現、精製に有利な場合がある。すなわち、タンパク質構造内にタグ配列がもぐりこんだ場合に比べ、精製用樹脂とヒスチジン残基がたやすく結合でき、目的タンパク質の精製が容易になる。本システムに含まれるTALON樹脂を組み合わせることで、変性条件下、非変性条件下のいずれでも簡単に目的タンパク質精製を行える（表2）。

図1. TALON Superflowを用いたHATタグ融合タンパク質のFPLC精製
pH7.0の50 mMリン酸ナトリウム、0.3 M塩化ナトリウム、5 mMイミダゾール溶液でE. coli細胞を抽出し、150 mMイミダゾール溶液で溶出した。
パネルA：TALON Superflow Columnで細胞ライセートを精製した。
パネルB：SDS-PAGEによる解析結果　M：分子量マーカー

表1. ポリヒスチジンタグ配列

タグ	アミノ酸配列
6×His	His -His -His -His -His -His
6×HN	His -Asn -His -Asn -His -Asn -His -Asn -His -Asn -His -Asn
HAT	Lys -Asp -His -Leu -lle -His -Asn -Val -His -Lys -Glu -Glu -His -Ala -His -Ala -His -Asn -Lys

表2. HATタンパク質発現&精製システム

HAT Systemの特徴	利点
長いタグ	高分子量タンパク質に最適
タグを通して均一に分布する電荷	高い溶解度
独自の天然の配列を使用	宿主細胞に対する毒性の可能性を低下
生理的pHで精製	目的タンパク質の構造を維持

pHAT Vectors
HAT SystemはpHA10/11/12という3種類のpHAT Vectorを含んでいる。これらは同一のコンストラクトで、3通りのリーディングフレームでマルチクローニングサイト（MCS）を有している。なお、ベクター内にはエンテロキナーゼ（EK）切断部位が組み込まれており、精製したタンパク質からHAT配列を除去することができる。また、制限酵素部位を利用してHAT配列をEKサイトと共に、または単独で切り取り、他のベクターにクローニングすることもできる。

図2. pHAT 10/11/12ベクターマップ

・pHAT10 Vector
・pHAT11 Vector
・pHAT12 Vector
・pHAT-DHFR Control Vector
・TALON Resin
・Buffer A
・Buffer B
・Buffer C
・Guanidine HCl
・Disposable Plastic Columns

Buffers、TALON Resin：4℃
カラム：室温
その他のコンポーネント：－20℃