- イルミナ社次世代シーケンス解析のためのcDNA調製キット
- 細胞やtotal RNAから簡単、シンプルな1チューブプロトコール
- 1細胞または10 pgのtotal RNAから超高感度cDNA調製
- サンプル液量は9 μlまで持ち込み可能なので濃度が薄く液量の多いサンプルにも対応
- 高品質のRNA-Seqデータを取得可能
－完全長遺伝子解析により全トランスクリプトーム情報を取得
－5’端、3’端でのcDNA合成のバイアスがない
－rRNA配列の混入は2％以下
－エキソンを幅広くカバー
－高い相関性（ERCC correlation）
製品説明
SMARTer Ultra Low Input RNA for Illumina Sequencing - HVは、非常に少量の細胞やtotal RNAからのトランスクリプトーム解析（RNA-Seq）用のライブラリー作製に有用なcDNA調製キットである。本製品は、わずか1～1,000個の細胞、またはごく微量のtotal RNA（10 pg～10 ng）からのcDNA調製に適している。調製されたcDNAは、イルミナ社のNextera DNA sample preparation kit（クロンテックの改良プロトコール使用）を用いてライブラリーを作製し、Genome Analyzerシステム、HiSeqシステム、MiSeqシステムで使用することができる。
本製品はoligo dTプライマーを利用しており、分解の少ない質のよいRNA（RIN＞8）、または損傷のないインタクトな細胞をサンプルとして使用する。1～9 μlのサンプル量が使用可能であるため、濃度の薄いRNAサンプルやソーティングにより液量が増えた細胞サンプルも使用可能である。
本製品はoligo dTプライマーを利用しており、分解の少ない質のよいRNA（RIN＞8）、または損傷のないインタクトな細胞をサンプルとして使用する。1～9 μlのサンプル量が使用可能であるため、濃度の薄いRNAサンプルやソーティングにより液量が増えた細胞サンプルも使用可能である。
SMART technology
SMART（Switching Mechanism At the 5’End of the RNA Template）技術は、遺伝子の全長をカバーでき、遺伝子の全長解析、スプライスジャンクション解析、細胞中でのスプライシング現象の解析など、トランスクリプトーム解析において威力を発揮する優れた技術である。
図1. シーケンス解析までの流れ
極微量RNAからの遺伝子発現データはqPCRデータと強い相関性を示す
MicroArray Quality Control（MAQC）プロジェクトからのUniversal Human Reference Total RNA（UHR）とHuman Brain Reference RNAの各1 ngを、SMARTer Ultra Low RNA Kitを用いたシーケンスデータの発現比較と、定量PCR（qPCR）による発現比較をスキャッタープロットにより解析した。
約700種の遺伝子の発現差では相関係数0.94を示し、本製品により調製されたcDNAのシーケンス結果は他の遺伝子発現技術の結果とよく一致した（図2）。
図2. 極微量RNAを用いたcDNAシーケンス解析結果と定量PCR結果の相関性
約700種の遺伝子の発現差では相関係数0.94を示し、本製品により調製されたcDNAのシーケンス結果は他の遺伝子発現技術の結果とよく一致した（図2）。
図2. 極微量RNAを用いたcDNAシーケンス解析結果と定量PCR結果の相関性
SMARTer Ultra Low RNAで増幅したcDNAの電気泳動
さまざまな量のUniversal Human Reference Total RNA（UHR）とHuman Brain Reference RNAからSMARTer cDNA合成を行い、合成されたcDNAの純度と合成量をAgilent 2100 バイオアナライザーを用いて解析した（図3）。合成cDNAは0.4～9 kbにわたって分布しており、最も高いピークは2 kb前後に確認された。ネガティブコントロールでは増幅は確認されなかった（ピンク）。広範囲のRNA量（例：1 ng～0.01 ng）から、PCRサイクル数を調整することにより、同程度のcDNAを調製することができる。
図3. さまざまなRNA量から合成したcDNAの電気泳動
図3. さまざまなRNA量から合成したcDNAの電気泳動
遺伝子カバー率
SMARTer Ultra Low RNA Kitを用いて1 ngから0.01 ngのmouse brain total RNAからcDNAライブラリーを作製しシーケンス解析を行った時の転写領域の平均リード数を比較した（図4）。
図4．インプットRNA量と転写産物領域の比較
X軸は、各遺伝子長を100％として表し、数値0は遺伝子転写産物の5’端を、数値100は3’端を示している。Y軸は、脳組織で中程度から高発現の724遺伝子について、その平均転写産物のカバー率を示す。本キットにより作製されたcDNAライブラリーでは、使用RNA量に関らず、遺伝子のほぼ全領域をカバーしており、5’端や3’端でのcDNA合成のバイアスは見られない。
図4．インプットRNA量と転写産物領域の比較
X軸は、各遺伝子長を100％として表し、数値0は遺伝子転写産物の5’端を、数値100は3’端を示している。Y軸は、脳組織で中程度から高発現の724遺伝子について、その平均転写産物のカバー率を示す。本キットにより作製されたcDNAライブラリーでは、使用RNA量に関らず、遺伝子のほぼ全領域をカバーしており、5’端や3’端でのcDNA合成のバイアスは見られない。
内容
BOX1
SMARTer II A Oligonucleotide（24 μM）
Control Total RNA （1 μg/μl）
BOX2Control Total RNA （1 μg/μl）
3’SMART CDS Primer II A（24 μM）
IS PCR Primer（12 μM）
5×First-Strand Buffer（RNase-Free）
SMARTer dNTP Mix（dATP, dCTP, dGTP, and dTTP, each at 20 mM）
Dithiothreitol（DTT; 100 mM）
SMARTScribe Reverse Transcriptase（100 U/μl）
Nuclease-Free Water
RNase Inhibitor（40 U/μl）
Dilution Buffer
Purification Buffer（10 mM Tris-Cl, pH 8.5）
Advantage 2 PCR Kit（製品コード 639207）IS PCR Primer（12 μM）
5×First-Strand Buffer（RNase-Free）
SMARTer dNTP Mix（dATP, dCTP, dGTP, and dTTP, each at 20 mM）
Dithiothreitol（DTT; 100 mM）
SMARTScribe Reverse Transcriptase（100 U/μl）
Nuclease-Free Water
RNase Inhibitor（40 U/μl）
Dilution Buffer
Purification Buffer（10 mM Tris-Cl, pH 8.5）
50×Advantage 2 Polymerase Mix
10×Advantage 2 PCR Buffer
10×Advantage 2 SA PCR Buffer
50×dNTP Mix（10 mM each）
Control DNA Template（100 ng/μl）
Control Primer Mix（10 μM each）
PCR-Grade Water
10×Advantage 2 PCR Buffer
10×Advantage 2 SA PCR Buffer
50×dNTP Mix（10 mM each）
Control DNA Template（100 ng/μl）
Control Primer Mix（10 μM each）
PCR-Grade Water
保存
SMARTer II A Oligonucleotide（24 μM）、Control Total RNA（1 μg/μl）：－70℃
Dilution Buffer：－20℃（融解後は4℃保存）
Purification Buffer：－20℃（融解後は室温保存）
その他のコンポーネント：－20℃
Dilution Buffer：－20℃（融解後は4℃保存）
Purification Buffer：－20℃（融解後は室温保存）
その他のコンポーネント：－20℃
本製品以外に必要な試薬、機器（主なもの）
下記の製品は本キット中に含まれません。下記の製品はユーザーマニュアルに記載のProtocolで使用できることが確認されています。他製品では代替はできないため、ご注意ください。
- シングルチャンネルピペット： 10 μl、20 μlおよび200 μl 各1本
- 8連チャンネルピペット： 20 μl、200 μl 各1本
- フィルターピペットチップ： 10 μl、20 μlおよび200 μl 各1箱
- First-Strand cDNA 合成専用のPCR サーマルサイクラー
- High Sensitivity DNA Kit（Agilent社 Code. 5067-4626）
- IsoFreeze Flipper Rack（MIDSCI社 Code. TFL-20）
- IsoFreeze PCR Rack（MIDSCI社 Code. 5640-T4）
- Nuclease-free thin-wall PCR tube（0.2 ml ; USA Scientific社 Code. 1402-4700）
- Nuclease-free nonsticky 1.5-ml tube （USA Scientific社 Code. 1415-2600）
- Agencourt AMPure PCR Purification Kit（5 ml； Beckman Coulter社 Code. A63880、60 ml ； Beckman Coulter社 Code. A63881）
- MagnaBot II Magnetic Separation Device（プロメガ社 Code. V8351）
＊1回目の精製において使用する。 - Magnetic Stand-96（Ambion社 Code. AM10027）
＊2回目の精製において使用する。 - 96-well V-bottom Plate (500 μl)（VWR(Axygen)社 Code. 47743-996）
- MicroAmp Clean Adhesive Seal（ABI社 Code. 4306311）
- 80％ Ethanol
- Covaris社 DNA Shearing装置
用途
少量total RNA、および細胞サンプルを用いたIllumina社Genome Analyzer、HiSeqシステム、 MiSeqシステムによる次世代シーケンス解析のためのcDNA合成、ライブラリー作製
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