SMART-Seq^® mRNA Long Read

SMART-Seq mRNA Long Readは、微量サンプルからロングリードシーケンス用のcDNAを合成するキットで、特に微量サンプルからの全トランスクリプトーム解析に適しています。10 pg～100 ngのtotal RNA（RIN＞8）、または1～1,000個のインタクトな細胞から、Oligo dTプライマーを用いて完全長cDNAを合成し、続いてバーコードプライマーを用いてcDNA増幅することにより、最大96個のバーコード付きcDNAを合成できます。その後、Oxford Nanopore Technologies（ONT）社のプラットフォームでアダプターライゲーション、ライブラリー調製を行い、ロングリードシーケンスを実施します。一連の操作により、平均リード長約2 kb（N50）、8 kbを超える完全長転写産物の検出が可能です。
cDNA合成、バーコード付加、濃縮、バーコード付きcDNAのプールを含む一連の操作は1日半で完了し、本製品のワークフローは自動化、小型化にも適しています。本製品によって取得されたデータはタカラバイオが提供するプロトコールとファイルを用いて簡単にデマルチプレックスでき、ONT社のDoradoベースコーラーで使用することができます。
本製品のcDNA合成にはSMART（Switching Mechanism At 5’End of RNA Template）法を用いており、高い効率で完全長cDNA合成が可能です。転写産物の全長情報を効率的に取得することができ、転写産物アイソフォーム、遺伝子融合、点変異などの分析を可能にします。さらに、SMART法は感度と再現性が非常に高いため、サンプルのインプット量が少ない場合でも、他の方法に比べて、より多くの遺伝子を識別できます。本製品を用いることで、高い再現性、均一なカバレッジ、およびGCリッチ転写産物の正確な検出が可能です。

図1．ワークフロー
total RNA、または細胞からSMART-Seq LR Oligo-dTプライマーとMMLV由来の逆転写酵素（SMARTScribe Reverse Transcriptase）を用いて逆転写反応を行う。
各mRNAの5’末端まで逆転写が進むと5’末端への塩基のテ―リングが起こり、そこにSMART-Seq LR TSOがアニーリングして鋳型スイッチングにより5’末端にSMART-Seq LR TSOを鋳型とした配列が付加される。
SMART-Seq LR Index Plateに含まれるプライマーを用いた1回目のPCRによってバーコードを付加したcDNAが増幅される。
2回目のPCRによってバーコード付加されたcDNAが濃縮される。
サンプルをプールし、ONT社のLigation Sequencing Kit V14（Cat. No. SQK-LSK114）を用いて末端処理、シーケンスアダプター付加を行い、シーケンスを実施する。シーケンス後は、ONT社のGuppyを使用してベースコール、デマルチプレックスを行い、Cutadapt、Minimap2、SAMtools、Bedtools、Salmon等を用いて解析する。


図2．SMART-Seq mRNA Long Readで合成されたバーコード付きcDNAのサイズ分布
SMART-Seq mRNA Long Readを用いて10 pgまたは10 ngマウス脳total RNA（n＝8）からcDNAを合成し、Agilent High Sensitivity DNA Kitを用いて2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies）でcDNAのサイズ分布を測定した。
パネルB、C：10 pg（パネル B）および 10 ng（パネル C）のマウス脳total RNAの代表的なサンプルのリード長分布を示した。


図3. SMART-Seq mRNA Long Readによって調製されたライブラリーのリード分布と感度
SMART-Seq mRNA Long Readを用いて10 pgまたは10 ngのマウス脳total RNAからcDNAを合成し、ライブラリーを調製した。シーケンス後、ONT社のGuppyを用いてベースコール、デマルチプレックスし、それぞれのバーコードあたり400,000リードにダウンサンプリングした。
パネルA：ライブラリーのリード分布。いずれのインプット量でも一貫して優れた結果が得られた（10 ngの場合はn＝8、10 pgの場合はn＝7）。



図4. SMART-Seq mRNA Long Readの再現性
SMART-Seq mRNA Long Readを用いて10 ngマウス脳total RNAの96個のレプリケートサンプルからcDNAを合成した。96サンプル全てのバーコード付きcDNAをプールしてライブラリーを調製しシーケンスを実施した結果、高い再現性が確認された。


図5. SMART-Seq mRNA Long Readのカバレッジ
SMART-Seq mRNA Long Readを用いて10 pgまたは10 ngのマウス脳total RNAからcDNAを合成し、ライブラリー調製、シーケンスを行った。n＝8の平均値を用いて遺伝子全体のカバレッジを評価した結果、10 pgというごく少量のインプット量でも高いカバレッジが得られた。


図6. 細胞サンプルからのロングリードシーケンス
SMART-Seq mRNA Long Readを用いて、シングルセル、または1,000個のK562細胞からcDNAを合成し、ライブラリー調製、シーケンスを実施した。Guppyを使用してベースコール、デマルチプレックスし、バーコードあたり300,000リードにダウンサンプリングした。
パネル A：平均遺伝子数（シングルセルはn＝8、1,000個の細胞はn＝2）
パネル B：ピアソン相関（シングルセルn＝8の遺伝子マトリックスから算出）
パネル C：シングルセルのダウンサンプリング分析（リード深度あたりの遺伝子数、転写産物数を表示）


図7. 完全長アイソフォームと遺伝子融合の検出
SMART-Seq mRNA Long Readのワークフローに従って10 pgマウス脳total RNA、またはK562細胞のシングルセルからcDNA合成し、ライブラリー調製、シーケンスを実施した。ONT社のGuppyを用いてベースコール、デマルチプレックスし、Minimap2を用いてアライメントを実施した。
パネル A、B：10 pgマウス脳total RNAから検出された Snap25（パネル A）とNbr1（パネルB）のアイソフォーム、IVGで可視化
パネル C：K562細胞のシングルセルから検出されたNUP214::XKR3 遺伝子融合、IVGで可視化


図8. SMART-Seq mRNA Long Readワークフローの自動化および小型化の検討
10 ngマウス脳total RNAの96個のレプリケート、およびシングルセルをサンプルとして、SMART-Seq mRNA Long Readのワークフローの自動化、および小型化を検討した。一方はベンチトップ上のマニュアル操作によって標準液量でcDNA合成を実施し、もう一方は自動化装置mosquito HV（SPT Labtech社）を用いて1/8の反応液量でcDNA合成を実施した。それぞれ96サンプル全てのバーコード付きcDNAをプールしてライブラリーを調製し、 72時間シーケンスした。ONT社のGuppyを用いてベースコール、デマルチプレックスし、Minimap2を用いてアラインメントした。
パネル A：mosquito HV 液体ハンドラー
パネル B：Salmonで評価した遺伝子数（マウス脳total RNA）
パネル C：マニュアル操作で合成したcDNAとmosquito HVで自動化、小型化して合成したcDNAの比較（シングルセル）


図9. mRNA Reference配列を用いた性能評価（測定濃度）
ERCC（External RNA Control Consortium）定量化コントロールとLong SIRV mRNA standardの両方を含む SIRV-Set 4（Lexogen社）をmRNA reference standardとして用い、SMART-Seq mRNA Long Readの性能を評価した。10 ngのマウス脳RNAにSIRV-Set 4をリードの約5%を占める量となる様にスパイクしてcDNAを合成し、ライブラリーを調製した。ONT社のMinIONでシーケンスし、Restranderツールを使用してFASTQデータのリード-ストランド補正を行い、minimap2で整列させてERCCスタンダードの理論濃度に対して測定濃度をプロットした。


図10. mRNA reference standardを用いた性能評価（IGVプロット）
ERCC（External RNA Control Consortium）定量化コントロールとLong SIRV mRNA standardの両方を含むSIRV-Set 4（Lexogen社）をmRNA reference standardとして用い、SMART-Seq mRNA Long Readの性能を評価した。10 ngのマウス脳RNAにSIRV-Set 4をリードの約5％を占める量となる様にスパイクしてcDNAを合成し、ライブラリー調製した。ONT社のMinIONでシーケンスし、Restranderツールを使用してFASTQデータのリード-ストランド補正を行い、minimap2で整列させた。
ERCCおよびSIRVアイソフォームセットに含まれる1 kb、4 kb、6 kb、8 kbのデータについてIGVプロットを示した。赤色のリードはプラス鎖リード、青色は非常に稀なマイナス鎖リード、小さな紫色または赤色のマークはONTシーケンスで一般的に見られる小さなインデル／変異を示している。なお、予想されるmRNA配列の少なくとも90％をカバーするリードを全長として定義した。


図11. SMART-Seq mRNA Long Readで合成したcDNAの完全性と方向性
Spike-In RNA Variant（SIRV）コントロール（600～2,492 bp）を用い、高い確率で転写産物（Transcript）全長を含むと考えられる全長cDNAの検出を行った。また、SIRVsuiteを用いてSIRV-spike-inに含まれる全てのアイソフォームの方向性を識別し可視化した。
パネル A：完全長cDNAのカバレッジ分析
パネル B：SIRVsuiteで可視化されたSIRV-spike-inの鎖方向の識別結果

Package 1：－70℃
Package 2：－20℃
　10X Lysis Buffer：解凍後は4℃保存
　Elution Buffer：解凍後は室温保存
（SMART-Seq LR Index Plateは12回以上凍結融解しないでください。）

下記の製品は本キット中に含まれません。下記の製品はユーザーマニュアルに記載のProtocolで使用できることが確認されています。

サンプル調製（セルソーティング）

• 8-tube strips（Thermo Fisher Scientific社 Cat. No. AB0264）またはセルソーティングに適したPCR tube strips、96 well plates
• Microplate film（USA Scientific社 Cat. No. 2920-0010）for sealing tubes/plates before sorting
• Aluminum single tab foil seal（USA Scientific社 Cat. No. 2938-4100）または cap strips（Thermo Fisher Scientific社 Cat. No. AB0784/AB0850）for sealing tubes/plates after sorting
• ドライアイス（細胞の凍結用）
• （オプション）BD FACS Pre-Sort Buffer (BD Biosciences社 Cat. No. 563503)
• （オプション）10X Lysis Buffer（製品コード 635013）

cDNA合成、PCR増幅

• PCRサーマルサイクラー 2台（cDNA合成用、PCR増幅用）
• Nuclease-free, PCR-grade, thin-wall PCR strips（0.2 ml PCR 8-tube strip; USA Scientific社 Cat. No.1402-4700）または同様のPCR-grade, thin-wall PCR tubes, strips, 96-well plates
• Nuclease-free, low-adhesion 1.5 ml tubes（USA Scientific社 Cat. No. 1415-2600）、DNA LoBind tubes（Eppendorf社 Cat. No. 022431021）または同様の核酸低吸着性チューブ
• Thermo Scientific Adhesive PCR Plate Seals（Thermo Fisher Scientific社 Cat. No. AB0558）for 96-well plates or cap strips（Thermo Fisher Scientific社 Cat. No. AB0784/AB0850）for 8-tube strips

Beads精製

• NucleoMag NGS Clean-up and Size Select（5 ml size：製品コード 744970.5；50 ml size：製品コード 744970.50；500 ml size：製品コード 744970.500）
  ※NucleoMagの代わりにAMPure XP PCR purification kit（Beckman Coulter社 5 ml size：Cat. No. A63880；60 ml size：Cat. No. A63881）も使用可能
• 80％エタノール（用時調製）
• Magnetic Separation Device
  〇24～96サンプルの場合：Magnetic Stand 96（Thermo Fisher Scientific社 Cat. No. AM10027）、V-bottom plates（500 μl; VWR, Cat. No. 47743-996）、adhesive PCR Plate Seals（Thermo Fisher Scientific社 Cat. No. AB0558）と組み合わせて使用
  〇1.5 mlチューブ（ライブラリーのプール用）の場合：Magnetic Stand (2 tubes)（製品コード 631964）、8-tube strips（Thermo Fisher Scientific社 Cat. No. AB0264）、またはnuclease-free、PCR-grade、thin-wall PCR tubes、strips、96-well plates

cDNA定量、ライブラリー定量（必要に応じて選択）

• High Sensitivity DNA Kit（Agilent Technologies社 Cat. No. 5067-4626）、High Sensitivity D5000 ScreenTape（Agilent Technologies社 Cat. No. 5067-5592）、または同等の高感度電気泳動法
• Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit（Thermo Fisher Scientific社 Cat. No. P11496）またはQubit dsDNA HS Assay Kit（Thermo Fisher Scientific社 Cat. No. Q32854）

その他

• シングルチャンネルピペット：10 μl、20 μlおよび200 μl
• 8連、あるいは12連チャンネルピペット：10 μl
• フィルターピペットチップ：10 μl、20 μl、および200 μl
• 1.5 mlチューブ用微量遠心機
• 0.2 mlチューブまたはstrip用微量遠心機