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Q&A

T4 DNA Ligase

T4 DNA Ligase

Q1 平滑末端と突出末端におけるライゲーション効率の差は?
A1 末端塩基配列にもよりますが(使用上の注意参照)、突出末端の方が100倍以上ライゲーションしやすくなります。

Q2 分子内ライゲーションより分子間ライゲーションが起こりやすくなるDNA濃度は?
A2 DNAの大きさにもよりますが、DNA濃度は薄ければ薄いほど分子内ライゲーションが起こりやすくなります。
理論上、計算式:51.1/(DNA濃度:g/l)÷(分子量:dalton)0.5の値が1より小さいと分子間ライゲーションの方が、2より大きいと分子内ライゲーションの方が起こりやすくなります5)

例)
λDNA
(48,502 bp)
1 μg/100 μlより濃いと分子間ライゲーションの方が起こりやすい。
1 μg/200 μlより薄いと分子内ライゲーションの方が起こりやすい。
プラスミドベクター
(約3,000 bp)
1 μg/25 μlより濃いと分子間ライゲーションの方が起こりやすい。
1 μg/50 μlより薄いと分子内ライゲーションの方が起こりやすい。


Q3 10%ポリエチレングリコール存在下、トランスフォーメーションをしてもよいのか?
A3 コンピテントセル100 μlあたりライゲーション溶液(10%PEGを含む)は10 μlまでなら大丈夫ですが、できればエタノール沈殿を行いバッファー交換する方が望ましいでしょう。

Q4 DNAを環状にしたいが塩濃度(NaCl、KCl等)はどのくらいがよいか?
A4 環状にしたい(セルフライゲーション)場合は一価の塩を含まないバッファーで行ってください。PEGと高塩濃度で促進されるのは分子間ライゲーションであり、分子内ライゲーションは塩濃度を含まないバッファーで行う方がよい結果が得られます。

Q5 力価表示が、文献値や他社の表示と異なっているが?
A5 タカラバイオのT4 DNA Ligaseは、λ-DNA Hind III分解物のライゲーション効率により力価を定義しているため、ATP-PPi交換反応で測定した力価表示(Weiss Unit)とは異なっています。
1 Weiss Unitは、タカラバイオのT4 DNA Ligaseの約125 Uに相当します。
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