DNA Blunting Kit

■操作手順

1. マイクロ遠心チューブ内で以下の反応液を調製し、全量を9 μlにする。

   突出末端インサートDNA＊1（0.1 pmol以上10 pmol程度まで）
   10×Buffer	1 μl
   滅菌蒸留水	up to 9 μl

2. DNA末端のアニーリングを防ぐため、70℃で5分間保温した後、37℃の恒温槽に移す。
3. T4 DNA Polymeraseを1 μl加え、ピペッティングによりおだやかに混和する（Vortex等による激しい撹拌は避ける）。
4. 37℃で5分間保温する^＊2。（時間厳守！）
5. Vortex等で激しく撹拌する。
   （DNA濃度が高い場合は、DNA Dilution Bufferを最終濃度1 μg DNA/50 μlになるように加え、Vortex等で激しく撹拌する。Vortexによる撹拌で酵素はほとんど失活するが、過剰の反応を避けるため氷水中に置き、すぐ次のライゲーション反応を行うこと。すぐ次の操作に移らない場合は、フェノール処理、エタノール沈殿してからDNA Dilution Bufferに溶解させ、－20℃で保存する。）

*1 DNAはエタノール沈殿等で精製したものを用いる。
*2 サンプルDNAのGC含量が低いと考えられる場合（例：ミトコンドリアのDNA等）には、反応を25℃で行うこと。

A．プラスミドベクターに外来DNAを挿入する場合

1. 末端を平滑化したインサートDNA適当量^＊3と脱リン酸化したベクター^＊4（50～100 ng）を含むDNA溶液（DNA Dilution Buffer中、5～10 μl）を用意する。
2. A-1の4～8倍量のLigation Solution Aを添加し、よく混合拌する。
3. A-1のDNA溶液と等量のLigation Solution Bを添加し、よく混合する。
4. 16℃で30分間保温する。
5. 形質転換を行う（コンピテントセル100 μlあたり、A-4の溶液20 μl以下）。

*3 ベクターとインサートDNAの混合比（モル比）は、ベクター1に対して、インサート5～10を推奨。
*4 脱リン酸化ベクターDNAの調製方法については「Alkaline Phosphatase（BAP, CIAP）による脱リン酸化反応」を参照。

B．直鎖状DNAの分子内ライゲーション（self circularization）の場合
使用方法はA. と同じである。ただしライゲーション反応に用いるDNA濃度は希薄なほど、またコンピテントセルに加えるDNA量が少ないほど、高い形質転換効率が得られる。

C．リンカーライゲーションの場合
使用方法はA. と同じである。ただしリンカーが不安定な構造（AT結合が多い、塩基数が少ない）の場合は、反応温度を4～10℃にすること。

• DNA Blunting Kitは、5’突出末端が脱リン酸化されたDNAでも平滑化できますが、3’陥没末端にリン酸基を持つDNAは平滑化できません。ショットガンクローニングの際、ソニックでDNAを分解すると、3’陥没末端にリン酸基を持つDNAが含まれる可能性がありますので注意してください。
• Ligation Solution A、Bは氷水中でVortex等により撹拌しながら融解させ、使用する直前にもう一度混合してください。凍結融解による失活はありません。
• 形質転換の際、フェノール処理～エタノール沈殿を行う必要はありません。ライゲーション後の全DNAを回収する場合は、直接エタノール沈殿を行ってください。