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Protocols

TB Green® Premix Ex Taq™ GC (Perfect Real Time)

LightCycler®/LightCycler®480を用いる場合の操作方法

TB Green Premix Ex Taq GC (Perfect Real Time)(製品コード RR071A/B)
  1. 下記に示すPCR反応液を調製する。
    <1反応あたり>
    試薬使用量最終濃度
    TB Green Premix Ex Taq GC (2×)10 μl
    PCR Forward Primer (10 μM)0.4 μl0.2 μM*1
    PCR Reverse Primer (10 μM)0.4 μl0.2 μM*1
    template (<100 ng)2 μl*2
    滅菌精製水7.2 μl 
    Total20 μl 

    *1 最終primer濃度は0.4 μMで良い結果が得られる場合が多いが、反応性に問題がある時は0.2~1.0 μMの範囲で最適な濃度を検討すると良い。

    *2 template溶液中に存在するターゲットのコピー数により異なる。段階希釈して適当な添加量を検討する。DNA template 100 ng以下を用いることが望ましい。また、RT-PCRでcDNA (RT反応液) をtemplateとして添加する場合は、添加量をPCR反応液容量の10%以下とする。



  2. PCRキャピラリーを遠心機で軽く遠心後、LightCyclerにセットし、反応を開始する。
    PCR反応は、下記のシャトルPCR標準プロトコールで行うことをお勧めします。まずはこのプロトコールを試し、必要に応じてPCR反応条件を至適化する。PCR条件を至適化する場合は下記の「PCR条件について」を参照してください。

    <Light Cycler>
    シャトルPCR標準プロトコール
    Stage 2:PCR反応
    シャトルPCR標準プロトコール

      Stage 1:初期変性
        95℃  30秒 20℃/秒
        1サイクル

      Stage 2:PCR反応
        95℃  10秒 20℃/秒
        60℃  30秒 20℃/秒
        40サイクル

      Stage 3:融解曲線分析
        95℃   0秒 20℃/秒
        65℃  15秒 20℃/秒
        95℃   0秒 0.1℃/秒


    < LightCycler 480 システム>
    シャトルPCR 標準プロトコール
    Denature
    95℃ 30 秒 (Ramp Rate 4.4℃/sec.)
    1 サイクル
    PCR
    Analysis Mode:Quantification
    95℃ 5 秒 (Ramp Rate 4.4℃/sec.)
    60℃ 30 秒 (Ramp Rate 2.2℃/sec., Acquisition Mode : Single)
    40 サイクル
    Melting
    Analysis Mode:Melting Curves
    95℃ 5 秒 (Ramp Rate 4.4℃/sec.)
    60℃ 1 分 (Ramp Rate 2.2℃/sec.)
    95℃ (Ramp Rate 0.11℃/sec., Acquisition Mode : Continuous, Acquisitions : 5 per℃)
    1 サイクル
    Cooling
    50℃ 30 秒 (Ramp Rate 2.2℃/sec.)
    1 サイクル

    ※使用上の注意
    本製品に使用しているTaKaRa Ex Taq HS はポリメラーゼ活性を抑制する抗Taq抗体を利用したホットスタートPCR用酵素です。他社の化学修飾タイプのホットスタートPCR酵素で必要なPCR反応前の95℃ (5~)15分の活性化ステップは行わないで下さい。必要以上の熱処理を加えると酵素活性が低下し、増幅効率、定量精度に影響を及ぼす傾向があります。
    PCR反応前に鋳型の初期変性を行う場合でも、通常95℃ 30秒で充分です。


  3. 反応終了後、増幅曲線と融解曲線を確認し、定量を行う場合は検量線を作成する。
    解析方法は、リアルタイムPCR装置の取扱説明書をご参照ください。

PCR条件について

【PCR条件の検討】
○反応特異性を上げるには
アニーリング温度を上げると反応特異性が改善することがある。増幅効率とのバランスを確認しながら、検討してください。
[シャトルPCR]
標準プロトコール

95℃10秒
 
60℃30秒

アニーリング温度を上げる

95℃10秒
 
~64℃30秒

○増幅効率を上げるには
伸長時間を延ばすか、3 step PCRに変更することにより、増幅効率が改善することがある。以下の手順で検討してください。
[シャトルPCR]
標準プロトコール

95℃10秒
 
60℃30秒

伸長時間を延ばす

95℃10秒
 
60℃1分~

[3 step PCR]
95℃10秒
 
55℃30秒
72℃30秒

伸長時間を延ばす
95℃10秒
 
55℃30秒
72℃1分~
【初期変性】
初期変性は通常95℃、30秒で十分である。環状プラスミドやゲノムDNAなど変性しにくい鋳型でも、ほとんどの場合、この条件で良好に反応できる。鋳型の状態によっては95℃、1~2分程度に延長することが可能であるが、時間が長すぎると酵素の失活を招く恐れがあるので、2分以上の条件は推奨しない。
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