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Protocols

TaKaRa PCR Carryover Prevention Kit

TaKaRa Taq Hot Start Version(製品コード R007A/B)を使用する場合

  1. 下記に示す反応液を氷上で調製する。
    鋳型(検体サンプル等)以外のコンポーネントを必要本数+α分調製し、反応チューブに分注後、軽くふたをする。

    TaKaRa Taq HS (5 U/μl)0.25 μl
    10×PCR Buffer(Mg2+ plus)*15 μl
    dU plus dNTP Mixture*2 4 μl
    MgCl2*2、31.5 μl
    UNG*2、40.5 μl
    (Template<500 ng)
    Primer 110~50 pmol(最終濃度0.2~1.0 μM)
    Primer 210~50 pmol(最終濃度0.2~1.0 μM)
    滅菌精製水Up to 50 μl

    *1 TaKaRa Taq Hot Start Version(製品コード R007A/B)に添付。

    *2 TaKaRa PCR Carryover Prevention Kitに添付。

    *3 dUTPはdTTPの3倍濃度に設定されているため、全体的にdNTP濃度が高くなる。PCR BufferにはMgCl2が含まれているが、MgCl2とdNTPの量のバランスを保つためMgCl2を追加する必要がある。10×PCR Buffer(Mg2+ free)を使用する場合には、4.5 μl添加する。

    *4 標準的な使用量は、50 μlの反応液量の場合、1反応あたり1 Uである。

  2. サンプル(鋳型)の添加
    1.で分注した反応液にサンプル(鋳型)を添加し、しっかりふたをする。
  3. 0.2 mlチューブ用の卓上遠心機で軽く遠心を行い、サーマルサイクラーにセットする。
  4. UNG処理とPCR増幅を行う。
    初めにUNG処理を行い、次にUNGの熱失活を行う。続いて、通常のPCR条件による増幅を行う。PCR条件は増幅サイズ等に応じて設定する。

    (例)1 kb DNAを増幅する場合
    25℃10分(UNG処理)*1
    95℃2分(UNGの熱失活)*1
    98℃10秒*2
     30サイクル
    55℃30秒
    72℃1分*3

    *1 UNG処理の条件は、増幅鎖長に関係なく一定である。

    *2 PCRの変性の条件は、サーマルサイクラーの使用機種と反応チューブの種類に合わせて設定する。設定の目安としては、98℃の場合は5~10秒、94℃の場合は20~30秒である。

    *3 本製品では、dTTPの代わりにdUTPを使用するため、やや増幅効率が低下する場合がある。増幅効率が悪い場合は、伸長反応時間を延長する。


  5. PCR 反応液を電気泳動等で分析する。
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