この画面を閉じる
  1. 下記に示す反応液を氷上で調製する。
    鋳型(検体サンプル等)以外のコンポーネントを必要本数+α分調製し、反応チューブに分注後、軽くふたをする。

    TaKaRa Taq HS (5 units/μl) 0.25 μl
    10×PCR Buffer for UNG plus 5 μl
    dU plus dNTP Mixture 4 μl
    UNG0.5 μl
    (Template<500 ng)
    Primer 1 10~50 pmol (最終濃度0.2~1.0 μM)
    Primer 2 10~50 pmol (最終濃度0.2~1.0 μM)
    滅菌精製水 Up to 50 μl

  2. サンプル(鋳型)の添加
    1.で分注した反応液にサンプル(鋳型)を添加し、しっかりふたをする。
  3. 0.2 mlチューブ用の卓上遠心機で軽く遠心を行い、サーマルサイクラーにセットする。
  4. UNG処理とPCR増幅を行う。
    始めにUNG処理を行い、次にUNGの熱失活を行う。続いて、通常のPCR条件による増幅を行う。PCR条件は増幅サイズ等に応じて設定する。

    (例)1 kb DNAを増幅する場合
    25℃ 10分(UNG処理) *1
    95℃2分(UNGの熱失活) *1
    98℃10秒*2
    30サイクル
    55℃30秒 
    72℃1分*3

    *1UNG処理の条件は、増幅鎖長に関係なく一定である。
    *2PCRの変性の条件は、サーマルサイクラーの使用機種と反応チューブの種類に合わせて設定する。設定の目安としては、98℃の場合は5~10秒、94℃の場合は20~30秒である。
    *3本製品では、dTTPの代わりにdUTPを使用するため、やや増幅効率が低下する場合がある。増幅効率が悪い場合は、伸長反応時間を延長する。

  5. PCR反応液を電気泳動等で分析する。
この画面を閉じる