プライマーがあればすぐ利用できるキャリーオーバー対策PCRキット
製品説明
エンドポイントPCRにおいて、特に食品・環境検査など同じPCR反応を繰り返し行う場合に、キャリーオーバーによる偽陽性が生じる危険性が高い。本製品は、継続的に使用することにより、このようなキャリーオーバーによる偽陽性を防止するための製品である。
本製品では、dTTPの代わりにdUTPを基質として用いて、ホットスタートPCR酵素TaKaRa Taq HSによる増幅を行う。PCR反応液調製後、ウラシルを含むDNAを分解する酵素であるUNG（Uracil - N - glycosylase）を作用させると、ウラシルを含む前段階におけるPCR産物はUNGにより分解されるが、あらたに加えられた鋳型は分解されないため、キャリーオーバーの影響を受けずにPCR増幅を行うことができる。
本製品では、dTTPの代わりにdUTPを基質として用いて、ホットスタートPCR酵素TaKaRa Taq HSによる増幅を行う。PCR反応液調製後、ウラシルを含むDNAを分解する酵素であるUNG（Uracil - N - glycosylase）を作用させると、ウラシルを含む前段階におけるPCR産物はUNGにより分解されるが、あらたに加えられた鋳型は分解されないため、キャリーオーバーの影響を受けずにPCR増幅を行うことができる。
UNGによる分解
UNGによる分解は次のように起こる。PCR前の25℃、10分の反応で、PCR反応液に混入しているウラシルを含むPCR産物のデオキシリボースとウラシル塩基の間のN- グリコシド結合がUNGにより加水分解され、脱ピリミジン部位が生じる。続いて95℃、2分の熱処理により、UNGが失活すると同時に混入DNA断片は脱塩基部位でリン酸バックボーンの加水分解により、切断、分解される。UNGは、一本鎖と二本鎖のウラシルを含むDNAを加水分解するが、RNAに対しては作用しない。
内容
R013S（50回分、PCR 50 μl反応系）
R013A（200回分、PCR 50 μl反応系）
| 1． | TaKaRa Taq HS（5 U/μl） | 12.5 μl |
| 2． | 10×PCR Buffer for UNG plus*1（10×） | 250 μl |
| 3． | dU plus dNTP Mixture*2（12.5×） | 200 μl |
| 4． | UNG（2 U/μl） | 25 μl |
| 1． | TaKaRa Taq HS（5 U/μl） | 50 μl |
| 2． | 10×PCR Buffer for UNG plus*1（10×） | 1 ml |
| 3． | dU plus dNTP Mixture*2（12.5×） | 800 μl |
| 4． | UNG（2 U/μl） | 100 μl |
| *1 | Mg2＋濃度：22.5 mM（10×） 本製品は、dUTP がdTTPの3倍濃度に設定されているため、全体的にdNTP濃度が高くなる。MgCl2とdNTPの量のバランスを保つため、通常のTaKaRa Taq Hot Start Version（製品コード R007A）に添付の10×PCR Buffer（Mg2＋ plus）よりMg2＋濃度が高くなっている。 | |
| *2 | dU plus dNTP Mixture：以下の組成の水溶液（ナトリウム塩）である。
dUTP 7.5 mM
dATP 2.5 mM dGTP 2.5 mM dCTP 2.5 mM |
保存
－20℃
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