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Human Mitochondrial DNA (mtDNA) Monitoring Primer Set(製品コード 7246)
本製品では、1種類のDNAサンプルにつき4反応(4種類のプライマーペアで反応)を行う。
まず、Primer Mix以外のマスターミックスを調製し、各々のチューブに24 μlずつ分注する。必要チューブ分のマスターミックスを調製する際は、下記<1反応あたり>の反応系を参考にする。最後に各Primer Mixを1 μlずつ分注する。この手順で反応液を調製すると、鋳型分注量の誤差によるバラツキを最小限に抑え、安定した結果を得ることができる。

<Thermal Cycler Dice Real Time System IIを用いる場合>
※ Thermal Cycler Dice Real Time System IIの取扱説明書に従って操作すること。

1.下記に示す反応液を氷上で調製する。
<1反応あたり>
 使用量終濃度
MightyAmp for Real Time (TB Green Plus)(2×)
  またはTB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(2×)
12.5 μl
Primer Mix (10 μM each)1 μl0.4 μM each
Genomic DNA (5 ng)2 μl
滅菌精製水9.5 μl
Total25 μl 
ゲノムDNA の推奨量は1反応あたり1~100 ngの範囲で添加すること。推奨量は10 ngである。
NucleoSpin Tissue等で調製した高純度DNAを使用すること。
また、OD260/OD280の比を測定し、高純度であることを確認すること。

2.下記に示す条件で反応を開始する。
 <MightyAmp for Real Time (TB Green Plus)を使用する場合>
Hold(初期変性)
Cycle:1
98℃ 2分
3 Step PCR
Cycles:40
98℃ 10秒
60℃ 15秒
68℃ 30秒
Dissociation

使用上の注意
MightyAmp DNA Polymeraseは強力なホットスタート抗体を使用しているので、必ず98℃ 2分の初期変性を行い、抗体を熱変性させること。

 <TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)を使用する場合を使用する場合>
Hold(初期変性)
Cycle:1
95℃ 30秒
2 Step PCR
Cycles:40
95℃ 5秒
60℃ 30秒
Dissociation


3. 反応終了後、データの解析を行い相対定量にてコピー数を算出する。
4つのターゲットそれぞれについて得られたCt値を用いて、mtDNAのコピー数を算出する。解析に用いるmtDNAとnDNA検出用プライマーペアの組み合わせは、最適化されてるので下記の手順に従って行うこと。最終的に各プライマーの組み合わせで算出した数値の平均値としてmtDNAのコピー数を算出する。
解析には、Microsoft Office Excelで作成されたmtDNAコピー数算出用のファイル*1が利用できる。Ct値を入力することで、mtDNAコピー数を算出することができる。
反復実験の結果は、最大5個まで入力することが可能である。また、最下段には、反復実験で得られたmtDNAコピー数の平均値も算出されるので、必要に応じて利用すること。
a.ND1/SLCO2B1ペアのCt値の差を求める。(ΔCt1=SLCO2B1のCt値-ND1のCt値)
b.同様にND5/SERPINA1ペアのCt値の差を求める。(ΔCt2=SERPINA1のCt値-ND5のCt値)
c.ΔCt1およびΔCt2の値から、2^N(N=ΔCt)を求める。
d.c .で得られた2つの数値の平均値をコピー数とする。
コピー数計算の一例
PrimerCt ValueΔCt2^ΔCt平均コピー数
ND1
15.75
ΔCt1=8.78440574
SLCO2B1
24.53
ND5
15.04
ΔCt2=9.47709
SERPINA1
24.51

*1 解析には、Microsoft Office Excelで作成されたmtDNAコピー数算出用のファイルが利用できます。以下からダウンロードしてご利用ください。
mtDNA_Copy_Number_Calculation (ZIP 9.0 K)
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