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Protocols

NucleoBond® Xtra BAC

ラージコンストラクトDNAのトランスフェクショングレード精製プロトコール

NucleoBond Xtra BAC(製品コード 740436.10、740436.25)
試薬の調製Buffer RES-BAC(+RNase A)*1が添付の英文説明書に従って調製、希釈されていることを確認する。
Buffer LYS-BACに沈殿が生じていないことを確認する。*2
1~3培養液の調製
集菌
培養液のOD600を測定し、培養液の推奨液量を求める。
培養液の液量(V)=1,500/ OD600(ml)培養液を、4℃、4,500~6,000×gで10分間以上遠心し、上清を除去する*3
4菌の懸濁菌体ペレットをBuffer RES-BAC(+RNase A)*1 60 mlに完全に懸濁する。
5菌の溶解Buffer LYS-BAC 60 ml*2を4の菌懸濁液に加え、5回倒置撹拌する。ボルテックスはしてはならない。
室温で、5分間静置する。
5分以上放置するとベクターDNAの分解や宿主菌のゲノムDNA混入の原因となるため注意する。
6カラムの平衡化
カラムフィルターを挿入したNucleoBond Xtra BAC Columnを、Buffer EQU-BAC 30 mlで平衡化する。
図に示すように、カラムの縁に沿ってバッファーを注ぐ。液を自然落下させてカラムを空にする。
フィルター全体が湿っていることを確認する。
7中和Buffer NEU-BAC 60 mlを、5の菌溶解液に加え、直ちに、穏やかに10~15回倒置撹拌して、溶液が無色になるまで混合する。ボルテックスはしてはならない。
氷上で5分間以上静置する。
8ライセートの清澄化とローディング7の溶液が入ったチューブを3回反転して沈殿が均一に懸濁された状態にした後、フィルターに加える。
液を自然落下させてカラムを空にする。
9カラムの洗浄(1回目)
Buffer EQU-BAC 15 mlでフィルターとカラムを洗浄する。
図に示すようにカラムの縁に沿ってバッファーを注ぎ、フィルターに残っている溶液を確実に洗浄する。
10カラムフィルターの廃棄
カラムからフィルターを引き抜く。あるいは、カラムを逆さにしてフィルターを除く。
11カラムの洗浄(2回目)
Buffer WASH-BAC 45 mlで、カラムを洗浄する。
12溶出65~70℃に予温したElution Buffer ELU-BAC 15 mlでDNAを溶出する。
溶出液を15 mlまたは50 ml遠心チューブ(各自で用意)に集める*4
13イソプロパノール沈殿溶出液の0.4倍(6 ml)のイソプロパノール(室温)を加え、ボルテックスで十分混合した後、室温で2分間静置する。
5,000×g以上で15分以上、室温以下(好ましくは15,000×gで30分間、4℃)で遠心する。
上清を注意深く除去する。
14DNAペレットの洗浄と乾燥70%エタノール(室温)5 mlを沈殿に加え、5,000×g(好ましくは15,000×g)以上で5分間、室温で遠心する。
エタノールをチューブから完全に除去する。
10~15分間乾燥する。(乾燥しすぎるとDNAが溶解しにくくなるので注意する。)
15DNAの溶解500~1,000 μlのTE Bufferまたは滅菌蒸留水を加えてDNAを溶解する(収量が少ないと予想される場合は500 μl以下で溶解してもよい)。4℃、オーバーナイトで完全に溶解させることが望ましい*5

*1 Buffer RES-BAC(+RNase A)の調製法
RNase A(凍結乾燥品)のチューブに1 mlのBuffer RES-BACを加えて完全に溶解し、全量をBuffer RES-BACのボトルに移す。
Buffer RES-BAC(+RNase A)は4℃で6ヵ月以上安定である。
*2 Buffer LYS-BACは使用前に沈殿が生じていないことを確認する。沈殿が確認された場合は30~40℃で数分間温めて撹拌し、沈殿を完全に溶解した後使用する。
*3 コピー数などにより、より多くの培養液が必要になる場合は以降のステップのRES-BAC, LYS-BAC, NEU-BACの使用量を菌体量に応じて増やす。
*4 溶出効率を上げるために、バッファーの温度が下がらないように注意する。溶出操作中、カラムを50~60℃に加温するか、65~70℃に温めたバッファーを2~3 mlずつに分けてカラムに加えてもよい。また、溶出後、更に予温したBuffer ELU-BAC 10 mlをカラムに加えて2回目の溶出を行うと回収量を上げることができる。
*5 長鎖DNAの切断を防ぐためピペッティングによる溶解は避ける。チューブを穏やかに振とうして溶解し、ピペッティングには広口のチップを用いる(チップの先を切断して用いることも可能)。


<注意>
使用時には、詳細は必ず添付の英文説明書をご確認ください。
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