NucleoSpin® miRNA

small RNA, large RNAの分画精製プロトコール（動物組織、培養細胞）

NucleoSpin miRNA（製品コード 740971.10、740971.50、740971.250）

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試薬の準備
　 Buffer MW2＊1 , rDNase溶液＊2が添付の英文説明書に従って調製、希釈されていることを確認する。
1. サンプルの溶解
組織サンプルの場合
30 mgまでの組織を用意し、それぞれの組織に適した方法で細分化処理を行う。
（例）液体窒素を加え、凍結しながら乳鉢で粉状にする、など。
細胞サンプルの場合
5×107個までの培養細胞を遠心で回収する。または、ディッシュ上で直接溶解する場合は、ディッシュ上の培地を出来る限り吸引除去する。

組織、または細胞にBuffer ML 300 μlを添加して、5回以上のピペッティングまたはvortexにより溶解する。
室温で5分間静置する。
2. ライセートのろ過
NucleoSpin Filter（紫色のリング）をCollection Tube（2 ml：蓋付）にセットする。
1.のライセートをNucleoSpin Filterに加え、11,000×g、1分間遠心する。
NucleoSpin Filterを取り除く＊3
3. エタノールの添加
ろ液300 μl＊4に対してエタノール150 μlを添加する。すぐにvortexで5秒間混合する。
室温で5分間静置する。
（エタノール添加後、凝集物が見える場合もスピンダウンは行わず、すべて4.のカラムに添加する。）
4. カラムへの吸着
NucleoSpin RNA Column（青色のリング）をCollection tube（2 ml：蓋付）にセットする。
3.の溶液をカラムに添加し、14,000×g、1分間遠心する＊5。
この操作でlarge RNAとDNAがNucleoSpin RNA Columnに吸着する。small RNAとタンパク質はろ液に含まれる。

Large RNAの精製（NucleoSpin RNA Columnからの精製）
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5. メンブレンの脱塩
4．のカラムを新しいCollection tube（2 ml）にセットする。
Buffer MDB 350 μlをカラムに添加する。
11,000×g、1分間遠心した後、ろ液を捨て、同じチューブにカラムをセットする。
6. DNAの分解
　 rDNase溶液＊2 100 μlをカラムに添加する。蓋を閉めずに室温で15分間以上反応させる。
（11．メンブレンの洗浄へ）

Small RNAの精製（ろ液からの精製） 横にスクロールできます
7. タンパク質の不溶化
4.のろ液にBuffer MP 300 μlを加え、蓋を閉めて、vortexで5秒間混合する。
8. タンパク質の除去
11,000×g、3分間遠心してタンパク質を沈殿させる。＊6
NucleoSpin Protein Removal Column（白色のリング）をCollection tube（2 ml：蓋付）にセットする。
上清をカラムに添加し、11,000×g、1分間遠心する。
9. Bufferの添加
NucleoSpin Protein Removal Columnを取り除き、800 μlのBuffer MXを添加する。
すぐにvortexで5秒間混合する＊7。
（Buffer MXの添加後、凝集物が見える場合もスピンダウンは行わず、すべて10.のカラムに添加する。）
10. カラムへの吸着
NucleoSpin RNA Column（青のリング）をCollection Tube（2 ml）にセットする。
9.の溶液725 μlを添加し、11,000×g、30秒間遠心する。ろ液を捨て、同じチューブにカラムをセットする。
この操作を繰り返し、すべての9.の溶液をカラムに加える。
（11.メンブレンの洗浄へ）

カラムの洗浄、溶出
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11. メンブレンの洗浄
1回目の洗浄
Buffer MW1 600 μlをそれぞれのカラムに添加する。
11,000×g、30秒間遠心した後、ろ液を捨て、同じチューブにカラムをセットする。
　 2回目の洗浄
Buffer MW2＊1 700 μlをそれぞれのカラムに添加する。 11,000×g、30秒間遠心した後、ろ液を捨て、同じチューブにカラムをセットする。
　 3回目の洗浄
Buffer MW2＊1 250 μlをそれぞれのカラムに添加し、11,000×gで2分間遠心してカラムを乾燥させる。
12. RNAの溶出
それぞれのカラムを新しいCollection Tube（1.5 ml）にセットする。
RNase-free H2O 30～100 μl＊8をカラムに加え、蓋を閉めずに室温で1分間静置する。
蓋を閉めて11,000×gで30秒間遠心してRNAを溶出する。

＊1：Buffer MW2
Wash Buffer RA3（Concentrate）に4倍量の96～100％エタノールを添加して、よく混合する。Buffer MW2は室温で1年間安定である。

＊2：rDNase溶液
rDNase （凍結乾燥品）1 vialにReaction Buffer for DNase 3 mlを加え、室温で1分インキュベートし、その後穏やかに混合し、完全に溶解する。
調製したrDNase溶液は小分けして、－20℃に保存する（6ヵ月間安定）。凍結融解は3回までとする。

＊3：ろ液に沈殿が見られた場合は、上清を別のチューブに移してから70％エタノールを添加する。

＊4：300 μl以上のろ液を処理する場合には、ステップ3のエタノール、ステップ7のBuffer MP、ステップ9のBuffer MXを比例して増量する。また一度でカラム処理ができない場合には、その作業を繰り返す。

＊5：カラム内部に溶液が残る場合には、カラムを180℃回転させてgのかかる方向を変え、再度遠心する。

＊6：沈殿にはタンパク質が含まれており、容易にSDS-PAGE、ウェスタン解析などに使用できる。詳細はsupplemtary protocol参照のこと。

＊7：微量サンプル（3 mg以下の組織、1×106個以下の細胞）から精製をしている場合、10 μｇ Carrier RNAを添加することで、収量を改善することができる。詳細はsupplemtary protocol参照のこと。

＊8：RNAの収量や濃度を上げたい場合は、溶出液量も変更することも可能である（supplemtary protocol参照）。



＜注意＞
使用時には、MACHEREY-NAGEL社のsupplementary protocolをご確認ください。 Supplementary protocol

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