この画面を閉じる

Protocols

NucleoSpin® miRNA

small RNA, large RNAの分画精製プロトコール(動物組織、培養細胞)

NucleoSpin miRNA(製品コード 740971.10、740971.50、740971.250)
試薬の準備
  Buffer MW2*1 , rDNase溶液*2が添付の英文説明書に従って調製、希釈されていることを確認する。
1. サンプルの溶解
組織サンプルの場合
30 mgまでの組織を用意し、それぞれの組織に適した方法で細分化処理を行う。
(例)液体窒素を加え、凍結しながら乳鉢で粉状にする、など。
細胞サンプルの場合
5×107個までの培養細胞を遠心で回収する。または、ディッシュ上で直接溶解する場合は、ディッシュ上の培地を出来る限り吸引除去する。

組織、または細胞にBuffer ML 300 μlを添加して、5回以上のピペッティングまたはvortexにより溶解する。
室温で5分間静置する。
2. ライセートのろ過
NucleoSpin Filter(紫色のリング)をCollection Tube(2 ml:蓋付)にセットする。
1.のライセートをNucleoSpin Filterに加え、11,000×g、1分間遠心する。
NucleoSpin Filterを取り除く*3
3. エタノールの添加
ろ液300 μl*4に対してエタノール150 μlを添加する。すぐにvortexで5秒間混合する。
室温で5分間静置する。
(エタノール添加後、凝集物が見える場合もスピンダウンは行わず、すべて4.のカラムに添加する。)
4. カラムへの吸着
NucleoSpin RNA Column(青色のリング)をCollection tube(2 ml:蓋付)にセットする。
3.の溶液をカラムに添加し、14,000×g、1分間遠心する*5
この操作でlarge RNAとDNAがNucleoSpin RNA Columnに吸着する。small RNAとタンパク質はろ液に含まれる。

Large RNAの精製(NucleoSpin RNA Columnからの精製)
5. メンブレンの脱塩
4.のカラムを新しいCollection tube(2 ml)にセットする。
Buffer MDB 350 μlをカラムに添加する。
11,000×g、1分間遠心した後、ろ液を捨て、同じチューブにカラムをセットする。
6. DNAの分解
  rDNase溶液*2 100 μlをカラムに添加する。蓋を閉めずに室温で15分間以上反応させる。
(11.メンブレンの洗浄へ)

Small RNAの精製(ろ液からの精製)
7. タンパク質の不溶化
4.のろ液にBuffer MP 300 μlを加え、蓋を閉めて、vortexで5秒間混合する。
8. タンパク質の除去
11,000×g、3分間遠心してタンパク質を沈殿させる。*6
NucleoSpin Protein Removal Column(白色のリング)をCollection tube(2 ml:蓋付)にセットする。
上清をカラムに添加し、11,000×g、1分間遠心する。
9. Bufferの添加
NucleoSpin Protein Removal Columnを取り除き、800 μlのBuffer MXを添加する。
すぐにvortexで5秒間混合する*7
(Buffer MXの添加後、凝集物が見える場合もスピンダウンは行わず、すべて10.のカラムに添加する。)
10. カラムへの吸着
NucleoSpin RNA Column(青のリング)をCollection Tube(2 ml)にセットする。
9.の溶液725 μlを添加し、11,000×g、30秒間遠心する。ろ液を捨て、同じチューブにカラムをセットする。
この操作を繰り返し、すべての9.の溶液をカラムに加える。
(11.メンブレンの洗浄へ)

カラムの洗浄、溶出
11. メンブレンの洗浄
1回目の洗浄
Buffer MW1 600 μlをそれぞれのカラムに添加する。
11,000×g、30秒間遠心した後、ろ液を捨て、同じチューブにカラムをセットする。
  2回目の洗浄
Buffer MW2*1 700 μlをそれぞれのカラムに添加する。 11,000×g、30秒間遠心した後、ろ液を捨て、同じチューブにカラムをセットする。
  3回目の洗浄
Buffer MW2*1 250 μlをそれぞれのカラムに添加し、11,000×gで2分間遠心してカラムを乾燥させる。
12. RNAの溶出
それぞれのカラムを新しいCollection Tube(1.5 ml)にセットする。
RNase-free H2O 30~100 μl*8をカラムに加え、蓋を閉めずに室温で1分間静置する。
蓋を閉めて11,000×gで30秒間遠心してRNAを溶出する。

*1:Buffer MW2
Wash Buffer RA3(Concentrate)に4倍量の96~100%エタノールを添加して、よく混合する。Buffer MW2は室温で1年間安定である。

*2:rDNase溶液
rDNase (凍結乾燥品)1 vialにReaction Buffer for DNase 3 mlを加え、室温で1分インキュベートし、その後穏やかに混合し、完全に溶解する。
調製したrDNase溶液は小分けして、-20℃に保存する(6ヵ月間安定)。凍結融解は3回までとする。

*3:ろ液に沈殿が見られた場合は、上清を別のチューブに移してから70%エタノールを添加する。

*4:300 μl以上のろ液を処理する場合には、ステップ3のエタノール、ステップ7のBuffer MP、ステップ9のBuffer MXを比例して増量する。また一度でカラム処理ができない場合には、その作業を繰り返す。

*5:カラム内部に溶液が残る場合には、カラムを180℃回転させてgのかかる方向を変え、再度遠心する。

*6:沈殿にはタンパク質が含まれており、容易にSDS-PAGE、ウェスタン解析などに使用できる。詳細はsupplemtary protocol参照のこと。

*7:微量サンプル(3 mg以下の組織、1×106個以下の細胞)から精製をしている場合、10 μg Carrier RNAを添加することで、収量を改善することができる。詳細はsupplemtary protocol参照のこと。

*8:RNAの収量や濃度を上げたい場合は、溶出液量も変更することも可能である(supplemtary protocol参照)。



<注意>
使用時には、MACHEREY-NAGEL社のsupplementary protocolをご確認ください。
http://www.mn-net.com/Portals/8/attachments/Redakteure_Bio/Protocols/RNA%20and%20mRNA/SP_NSmiRNA.pdf
この画面を閉じる