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Application

RetroNectin® (Recombinant Human Fibronectin Fragment)

正常ヒト神経前駆細胞への遺伝子導入

目的
神経前駆細胞から神経細胞への分化には、通常、培養基質としてLaminin (LM)などの細胞外マトリックスが用いられる。Lamininの代わりにRetroNectinを用いて、組換えレンチウイルス(VSV-Gエンベロープ)を用いた神経前駆細胞への遺伝子導入率、および分化した神経細胞の培養維持への影響について検討した。
材料
・標的細胞:正常ヒト神経前駆細胞
・培養容器:24 well plate
・ベクター:pLVSIN-CMV Pur Vector(製品コード 6183)にZsGreen1遺伝子を挿入したレンチウイルスベクター(6.2×105 IFU/ml, VSV-Gエンベロープ)、3倍希釈で感染
方法
正常ヒト神経前駆細胞を10 cmプレートで1日間培養した後、細胞を回収し、LamininコートプレートおよびRetroNectinコートプレートを用いて神経細胞への分化誘導および組換えウイルス感染を行った。RetroNectinを用いた遺伝子導入方法として、Supernatant法(静置感染)、Supernatant法(遠心感染)、RetroNectin Bound Virus infection(RBV)-Spin法を行った。比較対照として、ポリブレン法をLamininコートプレート上で行った。レンチウイルスベクターは、蛍光タンパク質ZsGreen1遺伝子を搭載したウイルス液を3倍希釈して用いた。分化誘導後の培養は2、3日おきに培地交換し、培養開始から17日目まで継続した。遺伝子導入効率は蛍光顕微鏡観察により評価した。
結果(Day17 顕微鏡観察)
Lamininコートプレートポリブレン法
RetroNectinコートプレートSupernatant法(静置感染)
Supernatant法(遠心感染)
RBV-Spin法
レトロネクチンを用いた導入実験で明らかにZsGreen1陽性細胞が多く確認できた。導入効率は、遠心感染>RBV-Spin法>静置感染であった。
Supernatant法(遠心感染)
RBV-Spin法
神経分化細胞の培養維持効果
Lamininコートプレート
RetroNectinコートプレート
Day17においてLamininコートプレートで一部の細胞の剥離が認められたが、RetroNectinコートプレートでは細胞剥離が少なく、細胞が良好に維持できた。
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