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TransIT-X2® Reagent

ZsGreen1発現293Tクローン細胞を用いたRNPでのゲノム編集

【実験の流れ】
【実験の流れ】
【方法】
試薬の準備
Cas9タンパク質:Guide-it Recombinant Cas9 (Electroporation-Ready)(製品コード 632641)
sgRNA:Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit(製品コード 632635)によりZsGreen1遺伝子に対するsgRNAを調製
遺伝子導入試薬:TransIT-X2(製品コード MIR6003)またはA社遺伝子導入製品。

1日目:細胞の準備
ZsGreen1発現293Tクローン細胞 (ZsGreen1を1 copy/cell保持)(293T-ZsGreen1細胞)を3.5×105 cells/mlに調製し、0.5 mlずつ24 well plateへ播種した。

2日目:RNPの細胞への導入
1.TransIT-X2 (24 well plate)の場合
  1. Opti-MEM I Reduced Serum Media 50 μlにCas9タンパク質とsgRNAを加えピペッティングした後、37℃で5分間インキュベート
  2. TransIT-X2を1 μl添加してピペッティング
  3. 室温で15~30分間インキュベート
  4. 細胞へ添加
2.A社遺伝子導入製品の場合
  製品protocolに準じて実施
4日目:細胞の継代

9日目:Flow cytometryによるノックアウト効率(ゲノム編集効率)の解析
ZsGreen1陰性細胞率(ノックアウト効率)をFlow cytometryを用いて解析した。
【結果】
293T-ZsGreen1細胞のZsGreen1ノックアウト効率を評価した。その結果、TransIT-X2では、BおよびC条件で50%以上のノックアウト効率が認められ、A社製品を用いた場合と比較して高いノックアウト効率を示した。NTは無処理の細胞を示す。(図1)

【結果】
(弊社取得データ)
図1. 293T-ZsGreen1細胞でのA社製品とのノックアウト効率の比較
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