T4 RNA Ligase

  • ●反応用バッファー添付
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製品コード TaKaRa
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資料
TKR 2050A 2050A T4 RNA Ligase
  • バルクなど特別対応可能
1,000 U ¥18,000
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TKR 2050B(A×5) 2050B(A×5) T4 RNA Ligase
  • バルクなど特別対応可能
5,000 U ¥69,000
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製品説明

本酵素は、5’-P末端のオリゴヌクレオチドと、3’-OH末端のオリゴヌクレオチドを結合させる酵素である。補酵素としてATPを要求する。分子内ライゲーションによる環化反応、分子間ライゲーションともに起こる。
最小基質はNpNpNOH(3’-OHオリゴマー、受容体)、pNp(5’、3’DPモノマー、供与体)である。ライゲーション効率は受容体、供与体それぞれの塩基に大きく影響される。DNAはRNAよりもかなり効率が悪い。

保存

-20℃

濃度

40 U/μl

形状

20 mM Tris-HCl(pH7.5)
50 mM NaCl
1 mM DTT
0.1 mM EDTA
50%グリセロール

添付Buffer組成(10×)

500 mM Tris-HCl(pH7.5)
100 mM MgCl2
100 mM DTT
10 mM ATP
0.1% BSA[別添付]*

* BSAが沈殿する恐れがあるので、凍結・融解はできるだけ避ける。

活性の定義

Oligo(A)nを基質として、5℃、10分間に1 pmolの[5'-32P]pCpを酸不溶性沈殿物に取り込む酵素活性を1 Uとする(RNA 3'末端標識反応)。

活性測定用反応液組成

50 mM HEPES-NaOH緩衝液(pH7.5)
20 mM MgCl2
3.3 mM DTT
6 μM ATP
0.001% ウシ血清アルブミン
10% DMSO
1.2 μM 3'-OH RNA
2.4 μM [5'-32P]pCp

純度

  1. 100 Uの本酵素と1 μgのλDNA-Hind III digestを37℃、16時間反応させても、DNAの電気泳動パターンに変化は起こらない。
  2. 100 Uの本酵素と1 μgの16Sおよび23S rRNAを37℃、16時間反応させても、RNAの電気泳動パターンに変化は起こらない。
  3. 20 Uの本酵素と6 μgのλDNA-Hind III digestを37℃、16時間反応させると、DNAはT4 DNA Ligaseによって90%以上ライゲーションされ、そのうち100%がHind IIIによって再切断される。
  4. 本酵素はSDS-PAGEにおいて90%以上の純度を示す。

使用上の注意

  • 分子間ライゲーションの至適反応温度は5~15℃で、それ以上では抑制される。
  • PEG共存下で反応は促進されるが、反応特異性に変化はない。
  • 10×添付Bufferに0.1%ウシ血清アルブミンを直接加えると多量の白沈が生じるので、反応液を調製する際は次の順番で試薬を加える。
    滅菌精製水→10×添付Buffer→0.1%BSA→基質RNA or DNA

用途

  • 一本鎖RNAおよび一本鎖DNAの3’-OH末端の標識
  • 一本鎖oligo RNA、一本鎖oligo DNAの連結

起源

Escherichia coli carrying the plasmid encoding T4 RNA ligase gene

一般的性質

  • 分子量
    約47,000
  • サブユニット
    シングルポリペプチドからなる球状タンパク質
  • 至適pH
    pH7.2~8.4、(分子間反応)HEPES-NaOH Buffer
    受容体がDNAオリゴマーの場合 pH8.3(ATP生成系なし)
    pH7.9(ATP生成系あり)
  • 補因子
    ATP(必須であるが1 mM以上で阻害、ATP:供与体=3:1程度がよい)
    dATPを用いると20%の効率しかない。他のNTPは代用にならない。
  • 活性化剤
    二価カチオン Mg2+(至適濃度:20 mM)
    受容体がDNAの場合はATP再成系に必要なMn2+の方がよい。
    DMSO 10~20%(40% DMSOでも活性あり)
    pCpを用いたRNAの末端ラベルで10% DMSOは2~3倍の活性化効果がある
    DNAオリゴマーへのpdNpの付加には効果がないが、10% DMSOで一本鎖
    DNAオリゴマーの連結は促進される。
    ヘキサアミンコバルトクロリド(HCC)
  • 還元剤
    DTT(1~20 mM、33 mM DTTでも阻害されない)
  • 阻害剤
    PPi、Pi、NH4(基質を脱塩すると効率が上がることがある)

参考

Yeast tRNAphe基質としたとき、上記反応液中で50 Uの本酵素を5℃で16時間作用させると、80%以上のtRNApheの3'末端が標識される。

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