shRNA発現用レトロウイルスベクター
製品説明
pSINsiベクターシリーズは、自己不活型レトロウイルスベクタープラスミドを基本骨格とし、RNA polymerase III (pol III) 系のプロモーターによりヘアピン型RNAを発現させるベクターである。pol III系のプロモーター（human H1、human U6、またはmouse U6）の下流のクローニングサイトにヘアピン型RNAを発現させるための合成オリゴDNA配列を挿入することによって、siRNA発現レトロウイルスベクタープラスミドが得られる。マーカー遺伝子としてはネオマイシン耐性遺伝子を搭載している。siRNA発現レトロウイルスベクタープラスミドから、Retrovirus Packaging Kit Eco/Ampho（製品コード 6160、6161）などを用いて、組換えレトロウイルスを調製することができる。
保存
－20℃
制限酵素地図
pSINsiベクターシリーズではプロモーターの異なる3種のプラスミドベクターを用意している。
pSINsiベクターの制限酵素地図
pSINsi-hH1 DNA： human H1 promoter (Accession S68670)を搭載。
pSINsi-hU6 DNA： human U6 promoter (Accession X07425)を搭載。
pSINsi-mU6 DNA： mouse U6 promoter (Accession X06980)を搭載。
pSINsi-hU6 DNA： human U6 promoter (Accession X07425)を搭載。
pSINsi-mU6 DNA： mouse U6 promoter (Accession X06980)を搭載。
pSINsiベクターの制限酵素地図
各ベクターのDNAシーケンスデータ
ZIP形式で圧縮しておりますが、StuffIt Expander等でも解凍できます。
pSINsi-hH1 DNAのシーケンスデータ（テキストファイル）
pSINsi-hU6 DNAのシーケンスデータ（テキストファイル）
pSINsi-mU6 DNAのシーケンスデータ（テキストファイル）
pSINsi-hU6 DNAのシーケンスデータ（テキストファイル）
pSINsi-mU6 DNAのシーケンスデータ（テキストファイル）
【注意】シーケンス上では、1259の位置（プロモーター上流、Hind IIIとEcoR Iの間）にCla Iサイトがありますが、通常のdam+大腸菌で調製したプラスミドは、dam methylaseによる影響を受けるため、1259位置のCla Iサイトは切断されません。
原理
pSINsiベクターシリーズのレトロウイルスベクタープラスミドは3'LTR U3領域のプロモーター活性を欠損させている。そのため、逆転写後、染色体に組み込まれたプロウイルスの状態では5'LTRのプロモーター活性が消失し、プロウイルス由来のmRNAは転写されなくなっており、pol III系のプロモーターからのヘアピン型RNAとSV40プロモーターからのネオマイシン耐性遺伝子のみが転写される。
発現したヘアピン型RNAは細胞内のDicerによる分解を受けてsiRNAとなる(下図参照）。
ヘアピン型RNA発現ベクター
発現したヘアピン型RNAは細胞内のDicerによる分解を受けてsiRNAとなる(下図参照）。
ヘアピン型RNA発現ベクター
ヘアピン型RNAを発現させるためのDNA合成
ヘアピン型RNAを発現させるためには、［Ligation用の制限酵素サイト＋標的配列（センス）＋ループ配列＋標的配列（アンチセンス）＋ターミネーター配列＋Ligation用の制限酵素サイト］の順でデザインした合成DNAをプロモーターの下流に挿入する。pSINsiベクターのクローニングサイトは、上流側はBamH I、下流側はCla Iである。
下図に示すような合成オリゴDNAを作製する（Top strandとBottom strandの2本； N部分が標的配列）。U6プロモーターの転写開始点はプリン塩基（GまたはA）が好ましいため、標的配列がGまたはAで始まらない場合は標的配列の前にGまたはAを挿入する。
ここではループ配列の例としてCTGTGAAGCCACAGATGGG（Boden et al. 参考文献 1)を挙げているが、GTGTGCTGTCC（Miyagishi et al. 参考文献 2)も有用であることが確認されている。また、これ以外のヘアピンループとして、Lee et al.(参考文献 3)、Paddison et al. (参考文献 4)、Paul et al.(参考文献 5)、Sui et al. (参考文献 6)らによってそれぞれ異なった配列が報告されている。
ターミネーター配列には、TTTTTT配列を用いる（Tが4つ続くとpol III系プロモーターによる転写が止まる）。siRNA配列と用いるヘアピンループ配列の組み合わせによってはTが4つ以上続く可能性があるため、合成DNAをデザインした後には必ず、Top strandにTが4つ以上続いていないことを確認することが必要である。
下図に示すような合成オリゴDNAを作製する（Top strandとBottom strandの2本； N部分が標的配列）。U6プロモーターの転写開始点はプリン塩基（GまたはA）が好ましいため、標的配列がGまたはAで始まらない場合は標的配列の前にGまたはAを挿入する。
ここではループ配列の例としてCTGTGAAGCCACAGATGGG（Boden et al. 参考文献 1)を挙げているが、GTGTGCTGTCC（Miyagishi et al. 参考文献 2)も有用であることが確認されている。また、これ以外のヘアピンループとして、Lee et al.(参考文献 3)、Paddison et al. (参考文献 4)、Paul et al.(参考文献 5)、Sui et al. (参考文献 6)らによってそれぞれ異なった配列が報告されている。
ターミネーター配列には、TTTTTT配列を用いる（Tが4つ続くとpol III系プロモーターによる転写が止まる）。siRNA配列と用いるヘアピンループ配列の組み合わせによってはTが4つ以上続く可能性があるため、合成DNAをデザインした後には必ず、Top strandにTが4つ以上続いていないことを確認することが必要である。
siRNA発現用組換えレトロウイルス作製の概要
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