miRNAなど低分子RNAのクローニングに最適

small RNA Cloning Kit

  • 低分子RNAから簡便に効率よくcDNAを合成
  • 増幅したcDNAはそのままTAクローニング可能
メーカー
略称
製品コード TaKaRa
Code
製品名 容量 価格(税別) 特記事項 説明書
データシート
ベクター情報
参考
資料
TKR RR065 RR065 small RNA Cloning Kit
  • バルクなど特別対応可能
10回 ¥89,000
説明書・データシート・ベクター情報

製品説明

細胞内で発現しているRNAの中に、タンパク質をコードしていないものが多く存在し、それらが重要な機能を持つことが明らかになってきた。これらは機能性RNAという名称で分類されているが、その中でも特に18~26塩基程度の低分子RNA(smallRNA、miRNAなど)の機能が注目されている。これら低分子RNAの機能としては、
 (1) 遺伝子発現をmRNAレベルで抑制する
 (2) 遺伝子発現を翻訳レベルで抑制する
ことがこれまでに示されている1)、2)
低分子RNAの発現解析を行う手段の一つとして、クローニングによる解析がある。低分子RNAはmRNAのようなpolyA tailを持たないため、分離した低分子RNA画分に対し、その5'側および3'側にRNAまたはRNA/DNAキメラのアダプターを結合させて逆転写し、PCRで増幅した後クローニングを行う方法が用いられている3)
本キットは、上記原理をもとにした低分子RNAのクローニング用cDNA増幅キットである。このキットでは、マグネットビーズの利用により、アダプター結合後のゲル抜きなどの煩雑な操作をできる限り除き、簡便な操作で低分子RNA由来cDNAを増幅できるよう工夫している。増幅したcDNAはそのままTAクローニングに用いることが可能である。また、アダプター配列中にある制限酵素サイトを利用したクローニングも可能になっている。

total RNAを電気泳動してゲル抜きを行うなどの操作で調製した低分子RNA(small RNA)を、本キットを用いてクローニングする場合の流れを図1に示す。
  1. 調製したsmall RNAをBAP処理することにより、5'側のリン酸基をはずす。
  2. BAP処理したRNAの3'側に、ビオチン化RNA/DNAキメラアダプターを結合させる。
  3. ストレプトアビジン結合磁気ビーズを用いてビオチン化アダプター結合small RNAを回収し、T4 polynucleotide kinaseにより5'側にリン酸基を付与する。
  4. 5'側に、RNA/DNAキメラアダプターを結合させた後、RT-primerを用いて逆転写酵素M-MLV4)により逆転写反応を行う。
  5. cDNAをビーズから回収し、PCRを行う。
  6. PCR フラグメントまたは制限酵素処理したフラグメントを回収し、クローニングを行う。

内容

Package 1
1. RNase Inhibitor40 U/μl50 μl
2. 10×BAP Buffer
200 μl
3. Alkaline Phosphatase (BAP)
20 μl
4. 0.1% BSA0.1%60 μl
5. 3' adaptor *1, *2
10 μl
6. T4 RNA Ligation Buffer
600 μl
7. T4 RNA Ligase40 U/μl20 μl
8. 5×T4 PNK Buffer
100 μl
9. T4 Polynucleotide Kinase10 U/μl10 μl
10. 5' adaptor *1
10 μl
11. 5×RT Buffer
40 μl
12. dNTP Mixture各2.5 mM90 μl
13. PCR-R & RT-Primer *1, *350 pmol/μl20 μl
14. RTase (RNaseH free) 200 U/μl10 μl
15. 2×PCR Buffer
250 μl
16. PCR Primer F *150 pmol/μl10 μl
17. TaKaRa Ex Taq HS5 U/μl10 μl
18. Control RNA *45 pmol/μl10 μl

Package 2
19. 3 M Sodium Acetate (pH5.2)200 μl
20. Dr. GenTLE Precipitation Carrier *580 μl
21. 2×B/W Buffer2.7 ml
22. Magnosphere MS300/Streptavidin100 μl
23. RNase-free dH2O10 ml

*1 3' adaptor、5' adaptor、PCR Primer FおよびPCR-R & RT-Primerには、Sse8387 Iのサイトが付加されている。PCR産物をSse8387 Iで消化することにより、Pst Iで切断したベクターに組み込むことができる。なお、本キットには制限酵素やクローニング用ベクターなどは含まれていないので、別途用意が必要である。
*2 3' adaptorはビオチン化されている。
*3 PCR用のreverse primer。逆転写プライマーとしても使用する。
*4 本キットに添付されているControl RNAは5’末端がリン酸化された21merの合成RNAである。
*5 Genとるくんエタ沈キャリア(製品コード 9094)と同じものである。

保存

Package 1:-20℃
Package 2:  4℃

キット以外に必要な試薬、器具類(主なもの)

    <試薬>
  • フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(25:24:1, v/v/v)

  • クロロホルム/イソアミルアルコール(24:1, v/v)

  • エタノール

  • TEバッファー(10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、pH8.0)

  • 0.1 N NaOH

  • DNAサイズマーカー
    20 bp DNA Ladder(製品コード 3409)など

  • RNAサイズマーカー
    14-30 ssRNA Ladder Marker(製品コード 3416)など

  • 10%ポリアクリルアミドゲル(未変性)

  • 15%ポリアクリルアミドゲル(変性)

  • 制限酵素Sse8387 I(製品コード 1183)

  • クローニング用ベクター

  • コンピテントセル

  • ライゲーション用試薬
    DNA Ligation Kit<Mighty Mix>(製品コード 6023)など

    <器具>
  • 微量遠心機(マイクロ遠心機)

  • 恒温水槽(次の各温度設定で使用;ヒートブロックも可)
    15℃、25℃、37℃、42℃、70℃

  • マイクロピペット

  • マイクロ遠心チューブ

  • サーマルサイクラー

  • PCR用0.2 mlチューブ

  • フィルター付きピペットチップ

  • アガロースゲル電気泳動装置一式

  • ポリアクリルアミドゲル電気泳動装置一式

  • マグネットスタンド
    Magnetight Separation Stand(製品コード 69964-3)など

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