Matchmaker™ Gold酵母ツーハイブリッド(Y2H)システム

  • GAL4ツーハイブリッドシステムでタンパク質-タンパク質間相互作用を検出・同定
  • Aureobasidin A耐性遺伝子を含む4つのレポーター遺伝子を採用
  • 新しいレポーターシステムにより偽陽性クローンの出現が大幅に低減
メーカー
略称
製品コード TaKaRa
Code
製品名 容量 価格(税別) 特記事項 説明書
データシート
ベクター情報
参考
資料
CLN 630489 Z0489N Matchmaker™ Gold Yeast Two-Hybrid System
  • 遺伝子組換
1 Set ¥144,200
説明書・データシート・ベクター情報
CLN 630498 Z0498N Y2HGold Yeast Strain
0.5 ml ¥83,400
説明書・データシート・ベクター情報
CLN 630442 Z0442N pGADT7 AD Vector
20 μg ¥91,700
説明書・データシート・ベクター情報
CLN 630443 Z0443N pGBKT7 DNA-BD Vector
20 μg ¥91,700
説明書・データシート・ベクター情報
CLN 630457 Z0457N Y187 Yeast Strain
  • 遺伝子組換
0.5 ml ¥77,300
説明書・データシート・ベクター情報

Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid Systemは、GAL4ツーハイブリッドに基づき、未知のタンパク質-タンパク質間相互作用を検出、同定できる極めて優れたシステムである。本システムは、2つの栄養要求性レポーター(ADE2HIS3)と、青白選択(MEL1;α-galactosidase)による判定に加え、感度の高い抗真菌抗生物質Aureobasidin A(AbA)(1)に対する耐性遺伝子(AUR1-C)をレポーターとして採用し、より簡単で厳密なスクリーニングが可能になった。
抗真菌抗生物質AbAは効果的に酵母を死滅させるが、Matchmaker Goldシステムで相互作用が見られる場合、酵母はAUR1-Cレポーター遺伝子の発現によりAbA耐性を獲得し、AbA添加培地でも生育する。本システムでは、3種類のGAL4応答性プロモーターで制御される4種類のレポーターを利用してスクリーニングを行うことで、偽陽性クローンの出現を低減させ、より確実な陽性クローン取得を可能にする。

Yeast Two-Hybridシステム概要
GAL4 Yeast Two-Hybridシステムは、タンパク質間相互作用を酵母を用いて簡便に検出、同定できる非常に優れた解析手法である。GAL4タンパク質が、DNA結合ドメイン(DNA-BD)と転写活性化ドメイン(AD)の2つのモジュールからなり、それぞれに分割しても、分割された2つのドメインがプロモーター上でごく近傍に位置する場合、強い転写活性能を示すことに基づいている(2、3)。
Matchmakerシステムでは、既知の“bait(おとり)”遺伝子、および、未知の“prey(獲物)”遺伝子を、それぞれDNA-BD、および、ADとの融合遺伝子となるようにベクター構築して酵母を形質転換する。baitタンパク質とpreyタンパク質の2つのタンパク質間で相互作用が見られる場合のみ、GAL4タンパク質の機能が回復し、酵母ゲノム中にコードされたレポーター遺伝子の転写が活性化される(図1)。Matchmaker Goldシステムでは、相互作用するbaitとpreyを発現する酵母クローンは、4つのレポーター遺伝子により検出、同定される(図2)。ライブラリーを用いるスクリーニングでは、レポーター遺伝子を発現する候補酵母クローンが選択培地上に生育するため、プラスミドを回収し、さらなる解析やシーケンスに用いることができる。


図1. Yeast Two-Hybridシステムの原理
ライブラリー由来のpreyタンパク質(GAL4 ADと融合して発現)が、baitタンパク質(GAL4 DNA-BDと融合して発現)と相互作用し、レポーター遺伝子の転写を活性化する。

4種類のレポーター遺伝子により得られる真の陽性クローン

Matchmaker Goldシステムの相互作用検出の厳密性は、本システムで用いる新しいY2HGold酵母株が、3種類のGAL4応答性プロモーター(MEL1、GAL1、GAL2)から転写される4種類のレポーター遺伝子AUR1-CHIS3ADE2MEL1を保持していることに基づいている(図2、表1)。特に4つめのレポーター遺伝子として新しく採用されたAUR1-C遺伝子の発現は、感度の高い抗真菌抗生物質AbAに対する耐性を酵母に付与するため、従来の栄養要求性レポーター遺伝子のみによるクリーニングで生じていた多数の偽陽性クローンの出現を大幅に低減させることができる。
これらのレポーター遺伝子はY2HGold酵母株のゲノム上にコードされており、4種類のレポーター遺伝子を活用することで、ある種のpreyタンパク質が一つのレポーター遺伝子上流のプロモーター領域に非特異的に結合し、偽陽性クローンを生じる可能性を強力に排除する。
Matchmaker Goldシステムでは、まず2種類のレポーター遺伝子(AUR1-CMEL1)による一次スクリーニングを行い、続いて4種類のレポーター遺伝子(AUR1-CMEL1HIS3ADE2)により厳密な選択を行う2段階スクリーニングを推奨している(図4:実験例1)。

Matchmaker Goldシステムの4種類のレポーター遺伝子
図2. Matchmaker Goldシステムの4種類のレポーター遺伝子
preyタンパク質とbaitタンパク質が相互作用すると、Y2HGold酵母株のゲノム中にコードされた3種類のGAL4応答性プロモーター(MEL1、GAL1、GAL2)制御下にある4種類のレポーター遺伝子の転写が活性化される。AbA耐性と2種類の栄養要求性レポーターによる培地上での生育の可否によって選択を行い、さらにα-galactosidaseレポーターによりX-α-Gal存在下でのコロニーの青色選択が行える。M1=MEL1 G1=GAL1 G2=GAL2

表1. Matchmaker Goldシステムの4種類のレポーター遺伝子
レポータータイプレポーター遺伝子相互作用陽性のクローンの形質
抗生物質耐性AUR1-C抗真菌抗生物質Aureobasidin A(AbA)に耐性
発色MEL1X-α-Gal存在下でコロニーが青色を呈す
栄養要求性HIS3ヒスチジンを含まない培地で生育可能
栄養要求性ADE2アデニンを含まない培地で生育可能

形質転換済みのMate & Plateライブラリー

スクリーニング用のライブラリーには、Y187酵母株に形質転換済みの各種Mate & Plateライブラリーが利用できる。Mate & Plateライブラリーとbaitタンパク質を発現するY2HGold株を共に培養し接合させるだけで、簡単にライブラリーから相互作用タンパク質をスクリーニングできる。また、Make Your Own “Mate & Plate” Library Systemを用いて、ご自身のサンプルからY187酵母株にオリジナルのライブラリーを構築することも可能である。
Matchmaker Goldシステムと酵母に導入済みのMate & Plateライブラリーを用いることで、最先端で最も簡便なYeast Two-Hybridスクリーニングをお試しください。

Mate & Plateプロトコール
図3. Mate & Plateプロトコール
preyタンパク質を発現するMate & Plateライブラリー(Y187酵母株に導入済み)を、baitタンパク質を発現するY2HGold株と共に培養して接合させることで、簡便にライブラリーから相互作用タンパク質をスクリーニングできる。

実験例

【実験例1】二段階スクリーニングにより高い割合で陽性クローンが得られるMatchmaker Goldシステム
図4. 【実験例1】二段階スクリーニングにより高い割合で陽性クローンが得られるMatchmaker Goldシステム
マウスOct4転写因子のPOUドメインをbaitにもつY2HGold酵母株と、Mate & Plate Universal Mouse Normalized Libraryを用いてOct4結合タンパク質のスクリーニングを行った。2種類のレポーター遺伝子(AUR1-CMEL1)による一次スクリーニング(選択培地:DDO+AbA, 60 ng/ml+X-α-Gal)により32コロニーをピックアップし、各コロニーを同じ選択条件培地(パネルA)ならびに4種類のレポーター遺伝子(AUR1-CMEL1HIS3ADE2)による厳密な選択培地(QDO+AbA, 60 ng/ml+X-α-Gal)(パネルB)に植え継ぎした。その結果、32コロニーのうち25コロニーが4種類のレポーター遺伝子すべてが活性化されている陽性コロニーであることが確かめられた。
DDO=Double dropout medium:SD/-Leu/-Trp
QDO=Quadruple dropout medium:SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp
baitタンパク質発現用pGBKT7 DNA-BDベクターの選択マーカー:TRP1
preyタンパク質発現用pGADT7 ADベクターの選択マーカー:LEU2

注:現在、ユーザーマニュアルでは、125 ng/ml濃度のAbAを含む培地上で、ライブライースクリーニングを行うことを推奨しています。

【実験例2】3種類のbait/preyペアを用いたAbA耐性の比較
図5. 【実験例2】3種類のbait/preyペアを用いたAbA耐性の比較
3種類のbait/prey融合タンパク質ペアをそれぞれ発現するY2HGold酵母株を用いて、各濃度のAbAを含むDDO(SD/-Trp/-Leu)寒天培地上でのコロニー形成能を調べた。各酵母のコロニー形成能はbait/prey融合タンパク質ペア間の相互作用の強度を反映することが分かる。
陰性コントロールペア(BD-POUmOct4+AD-null)、相互作用が推定されるペア(BD-POUmOct4+AD-E2I)、陽性コントロールペア(BD-p53+AD-T-Ag)

内容

・pGBKT7 DNA-BD Cloning Vector
・pGADT7 AD Cloning Vector
・pGBKT7-53 Control Vector
・pGBKT7-Lam Control Vector
・pGADT7-T Control Vector
・Y2HGold Yeast Strain
・Y187 Yeast Strain
・YPDA Broth
・YPDA with Agar
・SD/-Trp with Agar
・SD/-Leu with Agar
・Yeastmaker Yeast Transformation System 2(Box1, Box2)

保存

S. cerevisiae Strains:-70℃
培地、Yeastmaker Yeast Transformation System 2(Box2):室温
その他の試薬すべて:-20℃

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