O-157：H7をはじめとする腸管出血性大腸菌（EHEC）は、血便と激しい腹痛を伴う出血性大腸炎、さらには溶血性尿毒症症候群を引き起こす病原性大腸菌の一群である。これらの重篤な症状の原因は、EHECが産生する細胞毒素、ベロ毒素である。EHECの検出において、この毒素の産生能力の有無を的確に、かつ迅速にチェックする検査方法の重要性が、現在指摘されている。
本シリーズは、PCR法を用いた迅速なO-157ベロ毒素遺伝子の検出を目的とし、以下の製品からなる。
本シリーズは、PCR法を用いた迅速なO-157ベロ毒素遺伝子の検出を目的とし、以下の製品からなる。
・EHEC (VT gene) PCR Screening Set（製品コード RR120A）
・O-157 (ベロ毒素1型、2型遺伝子) PCR Typing Set（製品コード RR105A）
上記の製品を用いる検出法は、厚生労働省医薬食品局食品安全部監視安全課長通知（平成26年11月20日）「腸管出血性大腸菌O26、O103、O111、O121、O145及びO157の検査法について」（食安監発1120第1号）に収載されました。
詳しくはこちらをご覧ください・O-157 (ベロ毒素1型、2型遺伝子) PCR Typing Set（製品コード RR105A）
上記の製品を用いる検出法は、厚生労働省医薬食品局食品安全部監視安全課長通知（平成26年11月20日）「腸管出血性大腸菌O26、O103、O111、O121、O145及びO157の検査法について」（食安監発1120第1号）に収載されました。
製品比較表
| 製品名 | 特 長 | 製品に含まれる Primer （製品コード） |
検出できる遺伝子 | ターゲットDNA 増幅サイズ |
|||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| ベロ毒素1型 遺伝子 |
ベロ毒素2型 遺伝子 |
ベロ毒素2型の変異型遺伝子 | |||||||
| O-157 One Shot PCR Screening Kit Ver.2 | サンプルを入れるだけのReady-to-Use | EVC-1/2*（S008） | VT1 | VT2 | VT2vha | VT2vhb | VT2vp1 | 171 bp | |
| EHEC (VT gene) PCR Screening Set | インターナルコントロールあり | ||||||||
| O-157（ベロ毒素1型、2型遺伝子）One Shot PCR Typing Kit Ver.2 | 毒素の1型2型の判別をReady-to-Useタイプで | VT1/VT2用Primers | VT1 | 349 bp | |||||
| VT2 | VT2vha | VT2vhb | VT2vp1 | VT2vp2 | 112 bp | ||||
| O-157（ベロ毒素1型、2型遺伝子）PCR Typing Set | 毒素の1型2型の判別を安価に | EVT-1/2*（S006） | VT1 | 349 bp | |||||
| EVS-1/2*（S007） | VT2 | VT2vha | VT2vhb | VT2vp1 | 404 bp | ||||
| O-157（ベロ毒素1型、2型遺伝子）PCR Typing Set Plus | 検出できる変異型遺伝子が増えてさらに便利 | EVT-1/2*（S006） | VT1 | 349 bp | |||||
| EVS-1/EVC-2 | VT2 | VT2vha | VT2vhb | VT2vp1 | VT2vp2 | 112 bp | |||
VT表記とstx表記の対応表
| VT表記 | stx表記 |
| VT1 | stx1 |
| stx1亜型 stx1a stx1b stx1c stx1d |
|
| VT2 | stx2 |
| stx2亜型 stx2a stx2b stx2c stx2g | |
| VT2vha | stx2d |
| VT2vhb | |
| VT2vp1 | stx2e |
| VT2vp2 | stx2f |
上記のキット・セット以外に必要な試薬、機器（主なもの）
【試薬】
- 滅菌精製水
- PrimeGel Agarose PCR-Sieve（製品コード 5810A）
- 電気泳動用Buffer
Tris-Acetate-EDTA Buffer（TAE）50x Powder, pH8.3（製品コード T9131） - DNAマーカー
100 bp DNA Ladder（製品コード 3407A/B）または
Φ X174-Hinc II digest（製品コード 3406A/B）または
pHY Marker（製品コード 3404A/B） - Loading buffer（6×：36％ glycerol、0.05％ bromophenol blue、0.035％ xylene cyanol, 30 mM EDTA）（4. に記載されているDNAマーカーには添付されている）
- DNA染色剤
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain（製品コード 5760A/5761A）またはエチジウムブロマイドなど
- ヒートブロック（95℃まで温度を上げられるもの）
- 1.5 mlチューブ対応型冷却遠心機
- サーマルサイクラー
TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Touch（製品コード TP350：終売）
TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Gradient（製品コード TP600：終売）など
- 電気泳動装置
Mupid-2plus（製品コード M-2P）、Mupid-exU（製品コード EXU-1）など - UVトランスイルミネーター（300 nm前後のもの）
- 電気泳動ゲル撮影装置
- PCR用チューブ 0.2 ml Hi-Tube Dome Cap（製品コード NJ200）など
- 200 μl、20 μlマイクロピペット
- マイクロピペット用チップ
- ポラロイドフィルム
- アガロースゲル染色用トレイ（SYBR Green Iを使用する場合は、ポリプロピレン製容器を使用する。）
PCR反応の前処理
| [O-157 One Shot PCR Screening Kit／O-157 One Shot PCR Typing Kit] 増菌培養液4 μlを1.5 mlチューブまたは0.2 ml PCRチューブにとる ↓ 滅菌水196 μlを加えて混合する ↓ 95℃で5分間熱処理する ↓ 遠心分離（12,000 rpm、4℃、10分）し、上清を回収する ↓ 上清のうち50 μl ↓ PCR反応へ |
| [O-157 PCR Screening Set／O-157 PCR Typing Set] 増菌培養液10 μlを1.5 mlチューブにとる ↓ TE Buffer［10 mM Tris-HCl、0.1 mM EDTA（pH8.0）］または滅菌水90 μlを加えて混合する ↓ 95℃で5分間熱処理する ↓ 遠心分離（12,000 rpm、4℃、10分）し、上清を回収する ↓ 上清 （適量） ↓ PCR反応へ |
参考：食品からのPCR検出概略（都衛研法より抜粋）
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