シアル酸蛍光標識用試薬キット

本製品は、シアル酸を1,2-diamino-4,5-methylenedioxybenzene（DMB）により、蛍光標識するためのキットである。DMBによるシアル酸の蛍光標識法^{1, 2）}は、簡単で高感度な分析法である。サンプル中の遊離のシアル酸をDMB化し、逆相カラムを用いてHPLC分析することによって定量を行うことができる。サンプルを、あらかじめシアリダーゼ消化や酸加水分解することによって、シアル酸を遊離させておけば、糖タンパク質や糖脂質などの糖鎖に結合しているシアル酸の定量も可能となる。検出限界は57 fmol^{1, 2）}である。
このDMB化による分析と、糖鎖微量分析法であるピリジルアミノ化（PA化）法^{5, 6, 7）}とを組み合わせることにより、シアロ糖鎖の微量定量分析が可能となる。



図1 DMB法によるシアル酸の蛍光標識法

1.	DMB Solution*1	1 ml×2
2.	Coupling Solution（酢酸、 ハイドロサルファイトナトリウムを含む溶液）	5 ml×2
3.	Neu5Ac（100 μM）	500 μl

*1 Lotにより若干着色している場合がありますが、性能には影響ありません。

－20℃
（注意）DMB Solutionは遮光して保存する。

（1）遊離のシアル酸を含む試料^*1（各5 pmol～5 nmol）をスクリューキャップ付1.5 mlチューブに入れる。
*1 試料は50 μl以下にする。また、酸性下での反応のため試料のpHは中性又は酸性になるようにする。
（2）DMB Solution：Coupling Solution：H₂O ＝ 1：5：4の混合液^*2を調製し、試料に200 μl添加しよく撹拌する。遮光し、50℃にて2時間30分反応させる。
*2 混合した試薬は4℃で保存した場合、一週間は安定である。
（3）氷水中に入れて冷却し、反応を終了させる。
（4）反応液のうち10 μlを逆相カラムを用いたHPLCにて分析する。（励起波長：373 nm、測定波長：448 nm）
また、あらかじめ分析したスタンダードのシアル酸のHPLC Peak Heightより検量線を作成しておき、サンプル中のシアル酸量を求める。