1 ng~2 μgのtotal RNAからsmall RNAライブラリー調製可能

SMARTer® smRNA-Seq Kit for Illumina®

  • small RNA(15~150塩基)を対象としたイルミナ社次世代シーケンサー用ライブラリーを調製
  • 1 ng~2 μgのtotal RNA、またはsmall RNAからライブラリー調製可能
  • マルチプレックス用のIlluminaアダプター、インデックスをLigation-freeの手法で付加
  • 3時間でシーケンスライブラリーの調製が可能(サイズセレクションと確認のステップを除く)
SMARTer smRNA-Seq Kit for Illumina
RNA-Seq解析関連製品
メーカー
略称
製品コード TaKaRa
Code
製品名 容量 価格(税別)
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資料
CLN 635029 Z5029N SMARTer® smRNA-Seq Kit for Illumina®
  • NGS関連 サマーキャンペーン
  • ライセンス
12回 ¥143,000
¥114,400
2017/07/03~
2017/08/31

説明書・データシート・ベクター情報 参考資料
CLN 635030 Z5030N SMARTer® smRNA-Seq Kit for Illumina®
  • ライセンス
48回 ¥485,000
説明書・データシート・ベクター情報 参考資料
CLN 635031 Z5031N SMARTer® smRNA-Seq Kit for Illumina®
  • ライセンス
96回 ¥875,000
説明書・データシート・ベクター情報 参考資料

※色文字での表示は、キャンペーン価格およびそのキャンペーン期間です。

製品説明

small non-coding RNA(smRNA)の新規検索や解析は遺伝子発現調節を知る上で重要であり、現在知られているmiRNA、siRNA、piRNA、snoRNAなどのsmRNAは、主に20~30塩基のサイズに分布している。
SMARTer smRNA-Seq Kit for Illuminaは、1 ng~2 μgのtotal RNA、またはsmall RNAサンプルからイルミナ社次世代シーケンサー用のsmRNA-Seqライブラリーを作製するキットである。本製品は、SMART(Switching Mechanism at 5’End of RNA Template)テクノロジーとLNAテクノロジーを利用したSMART-Seq v4 kit技術を用いており、Ligationを行うことなくIlluminaアダプター、インデックスを付加することができ、バイアスの少ないライブラリーを作製することが可能である。

本製品は、total RNAまたはsmall RNAからライブラリー調製が可能である。total RNAを用いる場合は、ライブラリー作製後、SPRI Bead精製またはBluePippin Systemによるサイズ分画が必要である。
SMARTer smRNA-Seq Kit for Illuminaを用いたライブラリー作製の概要
図1.SMARTer smRNA-Seq Kit for Illuminaを用いたライブラリー作製の概要
まず、Oligo(dT)プライマーをアニーリングさせるために、インプットRNAの3’末端にpoly A配列を付加する(3’polyadenylation)。
次に3’smRNA dT Primerを用いてcDNA合成を行う。3’smRNA dT Primerの5’末端には1st アダプター配列(緑)が付加されており、逆転写反応によってcDNAにアダプター配列が付加される。更にMMLV由来の逆転写酵素PrimeScript Reverse TranscriptaseがRNAの5’末端に達すると、SMART法の原理により、cDNA鎖の末端に短い配列(xxxxx)が付加され、そこにSMART smRNA Oligoがハイブリダイズする。逆転写酵素は鋳型を乗り換え、SMART smRNA Oligoの末端までcDNA合成を続ける。なお、SMART smRNA OligoにはLNAテクノロジーが利用されており、SMART Oligoの感度が向上している。SMART smRNA Oligoには2nd アダプター配列(紫)が付加されているため、合成されたcDNAの3’末端に2ndアダプター配列が付加される。
続くPCR増幅のステップで、cDNAにマルチプレックス用のIlluminaアダプター配列、およびインデックス配列を付加する。Forward PCR PrimerはSMART smRNA Oligoの2ndアダプター 配列(紫)に結合し、Reverse PCR Primer は3’smRNA dT Primerの1stアダプター配列(緑)に結合する。その結果、Illuminaフローセルに必要なアダプター配列(P5:水色、P7:赤)とインデックス配列(Index 2 [i5]:オレンジ、Index 1 [i7]:黄色)がライブラリーのcDNAに付加される。
(注)最終的なライブラリーには、RNA配列に153 bpのアダプター配列が付加される。

small RNA-Seqライブラリーの正確性
図2.small RNA-Seqライブラリーの正確性
SMARTer smRNA-Seq Kit for Illuminaを用いて、963種類の合成miRNAを等モルずつ混合したmiRNAプール(miRXplore Universal Reference)1 ngからライブラリーを作製した(紫)。
また、比較のため、他社製品(Adapter ligation)を用いてmiRXplore Universal Reference 100 ngからライブラリーを作製した(青)。それぞれのシーケンス結果をマッピングしてリード数をカウントし、発現レベルを調べた。miRNA発現レベル(Y軸;対数表示)は、各miRNAで予想される発現レベルが全て1となるようにノーマライズし、上下2倍をカットオフとして2本の線で示した。なお、視覚化のため、X軸は発現レベル順にmiRNAを整列させた。

データの再現性
図3.データの再現性
SMARTer smRNA-Seq Kit for Illuminaを用いて各1 ngのhuman brain total RNA 2サンプルよりRNA-Seqライブラリーを作製し、BluePippin system(Sage Science社)を用いてサイズセレクションを行った。シーケンス結果をマッピングし、各ライブラリーで同定されたmiRNAの発現レベルの相関性を調べた(A)。また、1 ng、および2 μgのhuman brain total RNAからライブラリーを作製、シーケンス、マッピングを行い、各ライブラリーの相関性を調べた(B)。

内容

SMARTer smRNA-Seq Kit for Illumina Components
 Package 1
  ・Control RNA - miR163s (10 ng/μl)
  ・smRNA Mix 2
 Package 2
  ・smRNA Mix 1
  ・ATP
  ・RNase Inhibitor (40 U/μl)
  ・Poly(A) Polymerase (2 U/μl)
  ・3’smRNA dT Primer
  ・PrimeScript RT (200 U/μl)
  ・Nuclease-Free Water
  ・Tris Buffer (5 mM)

SeqAmp DNA Polymerase(製品コード 638504、または638509)
  ・SeqAmp DNA Polymerase
  ・SeqAmp PCR Buffer (2X)

Indexing Primer Set HT for Illumina
  Indexing Primer Set HT for Illumina - 12
  Forward PCR Primer HT Index 2
  Reverse PCR Primer HT Index 1~12
    12回用(製品コード 635029)に添付
  Indexing Primer Set HT for Illumina - 48 A
  Forward PCR Primer HT Index 1~4
  Reverse PCR Primer HT Index 1~12
    48回用(製品コード 635030)に添付
 2 X Indexing Primer Set HT for Illumina
  Forward PCR Primer HT Index 1~8
  Reverse PCR Primer HT Index 1~12
    96回用(製品コード 635031)に添付

NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(製品コード 740609.50、または740609.250)

保存

SMARTer smRNA-Seq Kit for Illumina Components
  Package 1:-70℃
  Package 2:-20℃
SeqAmp DNA Polymerase:-20℃
Indexing Primer Set HT for Illumina:-20℃
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up:室温

本製品以外に必要な試薬、機器(主なもの)

下記の製品は本キット中に含まれません。下記の製品はユーザーマニュアルに記載のProtocolで使用できることが確認されています。他製品では代替はできないため、ご注意ください。

PCR増幅およびバリデーション
・First-Strand cDNA合成専用のPCRサーマルサイクラー
・Double-Strand cDNA増幅専用のPCRサーマルサイクラー
• Agilent Bioanalyzer and Agilent High Sensitivity DNA Kit (Agilent社 Code 5067-4626)
(注)ライブラリーのバリデーションには、Advanced Analytical Fragment Analyzerと High Sensitivity Small Fragment Kit (Advanced Analytical, Code DNF-477) の組み合わせも使用可能
• Qubit Fluorometer、Qubit dsDNA HS Assay Kit(Thermo Fisher Scientific社 Code Q32851)、500-μl Assay Tube (Thermo Fisher Scientific社 Code Q32856)
• Nuclease-free thin-wall PCR tube(0.2 ml;USA Scientific社 Code 1402-4700)
• Nuclease-free low adhesion 1.5 ml tube(USA Scientific社 Code 1415-2600)またはLoBind tube(Eppendorf社 Code 022431021)

サイズセレクション(SPRI Bead精製;Protocol V.E)
• Agencourt AMPure XP PCR purification kit(5 ml Beckman Coulter社 Code A63880、60 ml Beckman Coulter社 Code A63881)
・Small volume用Magnetic stand:Magnetic Separator - PCR Strip(製品コード 635011)
・80% Ethanol

サイズセレクション(BluePippin System使用;Protocol V.F)
• BluePippin Size Selection System(Sage Science社 Code BLU0001)
• BluePippin 3% Agarose Gel Cassettes—for targets between 90 bp-250 bp(Sage Science社 Code BDF3010)

その他
・シングルチャンネルピペット: 10 μl、20 μlおよび200 μl 各2セット
・8連チャンネルピペット: 20 μl、200 μl
・フィルターピペットチップ: 2 μl、20 μlおよび200 μl
・1.5 ml tube用minicentrifuge
・0.2 ml tubeまたはstrip用minicentrifuge
・96~100%エタノール
・96 wellクーラーラック: IsoFreeze PCR Rack(MIDSCI社 Code 5640-T4)、または 96-Well Aluminum Block(Light Labs社 Code A-7079)

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注意事項
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