簡単操作で5 kbまでのノックインドナー用一本鎖DNAを効率的に調製可能

Guide-it™ Long ssDNA Production System v2

  • CRISPR/Cas9ノックインドナー用長鎖一本鎖DNA(ssDNA)調製キット
  • 500 bases~5 kbまでのssDNAが調製可能
  • 独自技術の「Strandase処理」で二本鎖を一本鎖化
  • クローニング操作、ゲル抜き精製不要の簡単プロトコール
  • 二本鎖DNAに比べてランダムインテグレーションが少ないため、ゲノム編集効率がUp
  • 反応系の改良により、より効率的なssDNA調製が可能に
   
メーカー
略称
製品コード TaKaRa
Code
製品名 容量 価格(税別)
キャンペーン価格
特記事項 説明書
データシート
ベクター情報
参考
資料
CLN 632666 Z2666N Guide-it™ Long ssDNA Production System v2
  • New
  • 導入システム編
  • 労働安全衛生法
  • 安全データシート(SDS)添付
  • ライセンス
50回 ¥78,000
¥62,400
2020/05/25~
2020/08/31

説明書・データシート・ベクター情報

※色文字での表示は、キャンペーン価格およびそのキャンペーン期間です。

※反応回数は従来製品(製品コード 632644)と同じです。
(センス鎖25回、アンチセンス鎖25回分)

製品説明

CRISPR/Cas9でのノックインはドナーDNAを作製し、主にCas9-sgRNA複合体もしくはCas9-sgRNA発現ベクターと共に導入することで起こる。
ドナーDNAとして二本鎖DNA(dsDNA)よりも一本鎖DNA(ssDNA)を使用したほうが、ランダムインテグレーションが起きにくく、細胞毒性が低いなど多くの利点があることが近年示されているが、長鎖のssDNAは作製が難しいため使用が制限されていた。
本製品は、CRISPR/Cas9のノックインドナーDNAとして使用できる、500 bases~5 kbまでの長鎖ssDNAを調製するためのシステムである。独自技術のStrandase処理により、PCR産物のセンス鎖またはアンチセンス鎖を選択的に分解することで、簡単な操作で最終的にセンス鎖もしくはアンチセンス鎖のssDNAが調製できる。
本製品にはssDNAを50回(センス鎖、アンチセンス鎖それぞれ25回)作製するために必要な試薬と、ssDNA精製用のNucleoSpin Gel and PCR Clean-upおよびバッファーが含まれている。
反応系の改良により、従来製品Guide-it Long ssDNA Production System(製品コード 632644)よりもStrandase処理の効率がさらに改善されており、これまで困難だったターゲットからも、より効率的なssDNA調製が可能となっている。

相同組換え(HDR)実験に使用するための長鎖ssDNA作製のフロー
図1.相同組換え(HDR)実験に使用するための長鎖ssDNA作製のフロー

まず、dsDNAテンプレートをクローニング、fusion PCR、または他の方法により調製する。テンプレートは目的遺伝子の他に、目的遺伝子を挿入する左右の隣接配列と相同のアームを含む必要がある。
次に、dsDNAテンプレートを片側のみリン酸化プライマーを使用してPCRを行い、異なる2種類のdsDNA産物を作製する(これらはそれぞれ、センス鎖ssDNA、アンチセンス鎖ssDNA作製のための鋳型となる)。
Strandase Mix Aを加えてセンス鎖もしくはアンチセンス鎖を分解する。Strandase Mix Aは5’がリン酸化された鎖だけを分解するので、センス鎖側またはアンチセンス鎖側を選択的に分解できる。次にStrandase Mix Bを加えて最終の分解を行い、ssDNAが得られる。
得られたssDNAをクリーンアップし、CRISPR/Cas9でのノックイン実験に使用する。
センス鎖、アンチセンス鎖両方のssDNAを調製し、それぞれ別々にノックイン実験を行うことを推奨する。

Cellartis human iPS cell line 18(ChiPSC18)の挿入サイト変異の確認
図2.Cellartis human iPS cell line 18(ChiPSC18)の挿入サイト変異の確認

AAVSにあるターゲットサイトのホモロジーアーム(600 bp)を含んだEF1αプロモーターおよびAcGFP1を含むssDNAドナーを作製し、ノックイン実験を行った。
GFP陽性クローンを単離した後、挿入されたサイトの正確性を調べるためにシーケンスを行った。その結果、すべてのクローンで目的遺伝子が正しい位置に挿入され、つなぎ目に変異が入っていないことが確認できた。

dsDNAテンプレートからのssDNAの作製
図3.dsDNAテンプレートからのssDNAの作製
Panel A:GAPDHまたはTyr geneへAcGFP1を挿入するための長鎖ssDNAを作製した。
一部のssDNAは、本来あるべきssDNAの長さより多少短くなっていた。
Panel B:CCR5 locus用の2~5 kbまでのssDNAの作製を行った。
ssDNA作製効率の改善

AS:アンチセンス鎖
SS:センス鎖

図4.ssDNA作製効率の改善

従来製品Guide-it Long ssDNA Production System (v1)では高純度のssDNAの調製が困難だったいくつかのdsDNAテンプレート(#1~#5)について、本製品(v2)を使用してssDNAを調製し、電気泳動で比較した。
すべてのケースにおいて、本製品Guide-it Long ssDNA Production System v2では、従来製品に比べて目的外の産物の少ないクリアなssDNAのバンドが確認でき、より完全で均一な選択的分解ができていることが示唆された。

HEK293細胞のGAPDHのC末端領域へのAcGFP1のノックイン
図5.HEK293細胞のGAPDHのC末端領域へのAcGFP1のノックイン

Panel A:GAPDHのexon 8領域にGAPDHとインフレームで融合するようにAcGFPを挿入するためのドナーssDNAテンプレートを本キットを使って作製した。
Panel B:HEK293細胞へ変異導入後のフローサイトメトリーの結果を示した。
直鎖状のdsDNAをドナーとして使用した場合は、Cas9とsgRNAの非存在下でも緑色の蛍光が観察された。一方センス、アンチセンス鎖のドナーssDNAテンプレートを使用した場合は、テンプレートがCas9とsgRNAが共に導入された場合のみ、蛍光が観察され、Cas9とsgRNA非存在下では、ほとんど蛍光は観察されなかった。

ellatis hiPSC18を用いたノックイン実験でのdsDNAおよびssDNAドナーテンプレートの細胞毒性の比較
図6.Cellartis hiPSC18を用いたノックイン実験でのdsDNAおよびssDNAドナーテンプレートの細胞毒性の比較

hiPSC18のtubulin領域にAcGFP1をノックインする実験を行った。
ノックインドナーをssDNA、もしくはdsDNAで用意し、Cas9+sgRNAと一緒にエレクトロポレーションで導入した。Cas9を加えない実験も同時に行った。
ドナーDNAは、インサートの両側に350 bの相同アームを持つ構造で長さは約1.5 kbである。
dsDNAドナーを用いた場合は、Cas9存在下・非存在下どちらにおいても顕著な毒性が見られた。

内容

Guide-it Long ssDNA Production System v2(製品コード 632666)
  • Guide-it Long ssDNA Strandase Kit v2(製品コード 632667)
    PrimeSTAR Max Premix (2X)625 μl×4
    Strandase Mix A250 μl
    Strandase A/B Buffer (10X)250 μl
    Strandase Mix B50 μl
    Digestion Enhancer (5X)500 μl
    RNase Free Water1 ml×5
    2-kb Control Template (2 ng/μl)50 μl
    Control Primer Mix (16 μM)50 μl
  • NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(製品コード 740609.50)   50回×2
  • Buffer NTC(製品コード 740654.100)   125 ml
本製品単独での販売はありません。

保存

Guide-it Long ssDNA Strandase Kit v2(製品コード 632667)-20℃
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(製品コード 740609.50)室温
Buffer NTC(製品コード 740654.100)室温

本製品以外に必要な試薬(主なもの)

ターゲット増幅用プライマー
(5’リン酸化プライマー 2種類、通常のプライマー 2種類 計4種類必要)

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注意事項
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