製品説明
Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit(製品コード 632635)は、in vitro transcription反応によりsgRNAを調製するキットである。従来品のプロトコールやコンポーネントを改良することにより、簡便に高品質sgRNAを高収量(12 μg以上)で調製できる。sgRNAの精製にスピンカラム式の精製キットGuide-it IVT RNA Clean-Up Kit(製品コード 632638)を採用しており、フェノール/クロロホルムを使わずに高純度精製が行える。精製したsgRNAは、そのまま細胞へのトランスフェクションやエレクトロポレーションに使用できる。
Guide-it Complete sgRNA Screening System(製品コード 632636)は、Guide-it sgRNA In Vitro Transcription KitとCas9タンパク質を含むGuide-it sgRNA Screening Kit(製品コード 632639)から構成されている。本キットを使って調製したsgRNAと添付のCas9タンパク質を組み合わせることで、sgRNAの有効性を実サンプルを用いることなくin vitroで確認できる。事前にsgRNAの有効性を確認することで、ワークする配列を実際の変異導入実験に用いることができ、失敗リスクを軽減できる。有効性を確認するためのターゲット配列は、添付のPCR酵素を使用してPCRによって調製するが、ダイレクトPCRが可能なTerra PCR Mixを採用しているので、サンプルからゲノムDNAを抽出する手間を省くことができる。調製したターゲット配列にsgRNAとCas9タンパク質を作用させ、アガロースゲル電気泳動によって切断効率(有効性)を確認する。
ここで紹介している製品シリーズは、従来品と製品名は同じであるが、いくつか改良点や変更点がある。
<従来品からの改良点・変更点>
Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit
- 容量が10回から50回に
- 転写開始点の変更により、sgRNAの収量が従来品の約3倍(12 μg以上)
- 鋳型DNA(sgRNA-encoding template)のPCR増幅にPrimeSTAR Maxを採用することで非特異的増幅が減り、原則ゲル切り出し精製は不要
- sgRNAの精製にカラム式のClean-Up Kitを採用することでフェノール/クロロホルム抽出が不要に
Guide-it sgRNA Screening Kit
- 容量が30回から50回に
- ターゲットDNA(DNA cleavage template)の調製にTerra PCR Mixを採用することで細胞からのダイレクトPCRが可能に
- Cas9タンパク質溶媒のグリセロール濃度が10%から50%に
図1. Guide-it sgRNA In Vitro Transcription and Screening Systemのフローおよびキット構成
図2. Guide-it sgRNA In Vitro Transcription and Screening Systemの操作ステップの概要
図3. 他社キットとの合成sgRNAの品質比較
Guide-it sgRNA
In Vitro Transcription Kitで調製したsgRNAと他社キットで調製したsgRNAを比較した。Guide-it sgRNA
In Vitro Transcription Kitで調製したsgRNAは全てシングルバンドとなっており、他社キットに比べて高品質であった。
図4. sgRNAの収量と品質
Guide-it sgRNA
In Vitro Transcription Kitを用いてsgRNAを調製(反応条件:20 μl、37℃、4時間)し、NanoDrop spectrophotometerでsgRNAの収量を調べた(パネルA)。
また、Agilent Bioanalyzerを用いてsgRNAの品質を調べた(パネルB)。
内容
Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit (製品コード 632635)
・Guide-it sgRNA
In Vitro Transcription Components v2
Guide-it Scaffold Template (1 ng/μl) | 50 μl |
Guide-it In Vitro Transcription Buffer | 350 μl |
RNase Free Water | 1 ml |
Guide-it T7 Polymerase Mix (33 U/μl) | 150 μl |
PrimeSTAR Max Premix (2X) | 625 μl |
Recombinant DNase I (RNase-Free) (5 U/μl) | 100μl |
•Guide-it IVT RNA Clean-Up Kit(製品コード 632638)
Guide-it IVT RNA Clean-Up Kit(製品コード 632638)
RNase Free Water | 13 ml |
IVT Binding Buffer | 3 ml |
IVT RNA Clean-Up Spin Column | 50個 |
IVT Wash Buffer | 6 ml×2 |
Collection Tubes (2 ml) | 50個 |
Guide-it Complete sgRNA Screening System (製品コード 632636)
・Guide-it sgRNA
In Vitro Transcription Kit(製品コード 632635)
・Guide-it sgRNA Screening Kit(製品コード 632639)
Guide-it sgRNA Screening Kit (製品コード 632639)
Guide-it Recombinant Cas9 Nuclease (500 ng/μl) | 25 μl |
15X Cas9 Reaction Buffer | 50 μl |
15X BSA | 50 μl |
Control sgRNA (50 ng/μl) | 15 μl |
Control Fragment (20 ng/μl) | 150 μl |
Terra PCR Direct Polymerase Mix (1.25 U/μl) | 50 μl |
2X Terra PCR Direct Buffer (with Mg2+, dNTP) | 1.25 ml |
RNase Free Water | 5 ml |
Extraction Buffer 1 | 5 ml |
Extraction Buffer 2 | 0.5 ml |
保存
Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Components v2:-20℃
Guide-it IVT RNA Clean-Up Kit:室温
Guide-it sgRNA Screening Kit:-20℃
キット以外に必要な機器、試薬
・96~100%エタノール
・イソプロパノール
・NanoDrop 2000 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific社. No. ND-2000)または同等品