Guide-it™ sgRNA In Vitro Transcription and Screening System

Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit（製品コード 632635）は、in vitro transcription反応によりsgRNAを調製するキットである。従来品のプロトコールやコンポーネントを改良することにより、簡便に高品質sgRNAを高収量（12 μg以上）で調製できる。sgRNAの精製にスピンカラム式の精製キットGuide-it IVT RNA Clean-Up Kit（製品コード 632638）を採用しており、フェノール／クロロホルムを使わずに高純度精製が行える。精製したsgRNAは、そのまま細胞へのトランスフェクションやエレクトロポレーションに使用できる。
Guide-it Complete sgRNA Screening System（製品コード 632636）は、Guide-it sgRNA In Vitro Transcription KitとCas9タンパク質を含むGuide-it sgRNA Screening Kit（製品コード 632639）から構成されている。本キットを使って調製したsgRNAと添付のCas9タンパク質を組み合わせることで、sgRNAの有効性を実サンプルを用いることなくin vitroで確認できる。事前にsgRNAの有効性を確認することで、ワークする配列を実際の変異導入実験に用いることができ、失敗リスクを軽減できる。有効性を確認するためのターゲット配列は、添付のPCR酵素を使用してPCRによって調製するが、ダイレクトPCRが可能なTerra PCR Mixを採用しているので、サンプルからゲノムDNAを抽出する手間を省くことができる。調製したターゲット配列にsgRNAとCas9タンパク質を作用させ、アガロースゲル電気泳動によって切断効率（有効性）を確認する。

ここで紹介している製品シリーズは、従来品と製品名は同じであるが、いくつか改良点や変更点がある。

＜従来品からの改良点・変更点＞
Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit

• 容量が10回から50回に
• 転写開始点の変更により、sgRNAの収量が従来品の約3倍（12 μg以上）
• 鋳型DNA（sgRNA-encoding template）のPCR増幅にPrimeSTAR Maxを採用することで非特異的増幅が減り、原則ゲル切り出し精製は不要
• sgRNAの精製にカラム式のClean-Up Kitを採用することでフェノール／クロロホルム抽出が不要に

Guide-it sgRNA Screening Kit

• 容量が30回から50回に
• ターゲットDNA（DNA cleavage template）の調製にTerra PCR Mixを採用することで細胞からのダイレクトPCRが可能に
• Cas9タンパク質溶媒のグリセロール濃度が10％から50％に

図1. Guide-it sgRNA In Vitro Transcription and Screening Systemのフローおよびキット構成



図2. Guide-it sgRNA In Vitro Transcription and Screening Systemの操作ステップの概要



図3. 他社キットとの合成sgRNAの品質比較
Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kitで調製したsgRNAと他社キットで調製したsgRNAを比較した。Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kitで調製したsgRNAは全てシングルバンドとなっており、他社キットに比べて高品質であった。



図4. sgRNAの収量と品質
Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kitを用いてsgRNAを調製（反応条件：20 μl、37℃、4時間）し、NanoDrop spectrophotometerでsgRNAの収量を調べた(パネルA)。
また、Agilent Bioanalyzerを用いてsgRNAの品質を調べた(パネルB)。

Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit （製品コード 632635)
・Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Components v2

Guide-it Scaffold Template (1 ng/μl)	50 μl
Guide-it In Vitro Transcription Buffer	350 μl
RNase Free Water	1 ml
Guide-it T7 Polymerase Mix (33 U/μl)	150 μl
PrimeSTAR Max Premix (2X)	625 μl
Recombinant DNase I (RNase-Free) (5 U/μl)	100μl

•Guide-it IVT RNA Clean-Up Kit（製品コード 632638)

Guide-it IVT RNA Clean-Up Kit（製品コード 632638)

RNase Free Water	13 ml
IVT Binding Buffer	3 ml
IVT RNA Clean-Up Spin Column	50個
IVT Wash Buffer	6 ml×2
Collection Tubes (2 ml)	50個

Guide-it Complete sgRNA Screening System （製品コード 632636）
・Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit（製品コード 632635)
・Guide-it sgRNA Screening Kit（製品コード 632639）

Guide-it sgRNA Screening Kit （製品コード 632639）

Guide-it Recombinant Cas9 Nuclease (500 ng/μl)	25 μl
15X Cas9 Reaction Buffer	50 μl
15X BSA	50 μl
Control sgRNA (50 ng/μl)	15 μl
Control Fragment (20 ng/μl)	150 μl
Terra PCR Direct Polymerase Mix (1.25 U/μl)	50 μl
2X Terra PCR Direct Buffer (with Mg2＋, dNTP)	1.25 ml
RNase Free Water	5 ml
Extraction Buffer 1	5 ml
Extraction Buffer 2	0.5 ml

Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Components v2：－20℃
Guide-it IVT RNA Clean-Up Kit：室温
Guide-it sgRNA Screening Kit：－20℃

・96～100％エタノール
・イソプロパノール
・NanoDrop 2000 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific社. No. ND-2000)または同等品