ゲノム編集後の変異導入効率確認キット
- CRISPR/Cas9などによるゲノム編集後の変異導入確認に
- 細胞のゲノムに導入された挿入、欠失をPCRベースの手法で簡単に検出
- 細胞からの直接増幅が可能で、他社アッセイキットより迅速、高効率
- 検出に必要な酵素に加えPCR酵素とバッファーが入った便利なキット
製品説明
Guide-it Mutation Detection Kitは、CRISPR/Cas9、zinc-finger nucleases（ZFNs）、transcription-activator-like effector nucleases（TALENs）などの人工ヌクレアーゼを用いた変異導入を確認するためのキットである。細胞ゲノム上に導入された挿入や欠失をPCRベースの手法で簡単、迅速に検出できる。
本製品では、Terra PCR Direct Polymerase Mixを用いることで、DNA精製を行うことなく、細胞ライセートから直接ターゲット配列を増幅することができる。
操作は、目的の細胞プールからターゲット配列を含む領域をPCR増幅し、増幅産物の変性、アニーリングを行った後、Guide-it Resolvaseによる切断処理を行う。アニーリングによってミスマッチが生じると、Guide-it Resolvaseによる切断が起こる。電気泳動での切断断片の確認により、変異を検出できる。
本製品には100回/25回の増幅と切断に必要な試薬が全て含まれている。また、本製品にはPositive Control DNAが含まれているので、反応系に問題がないかの確認も行える。
※本製品に含まれるTerra PCR Direct Polymerase Mixを用いて増幅したPCR産物の確認や、Guide-it Resolvaseによる切断効率確認のための電気泳動バッファーには、TAE Bufferの使用を推奨します。TBE Bufferを使用した場合、泳動パターンがスメアやスマイリングなどを生じる場合があります。
本製品では、Terra PCR Direct Polymerase Mixを用いることで、DNA精製を行うことなく、細胞ライセートから直接ターゲット配列を増幅することができる。
操作は、目的の細胞プールからターゲット配列を含む領域をPCR増幅し、増幅産物の変性、アニーリングを行った後、Guide-it Resolvaseによる切断処理を行う。アニーリングによってミスマッチが生じると、Guide-it Resolvaseによる切断が起こる。電気泳動での切断断片の確認により、変異を検出できる。
本製品には100回/25回の増幅と切断に必要な試薬が全て含まれている。また、本製品にはPositive Control DNAが含まれているので、反応系に問題がないかの確認も行える。
※本製品に含まれるTerra PCR Direct Polymerase Mixを用いて増幅したPCR産物の確認や、Guide-it Resolvaseによる切断効率確認のための電気泳動バッファーには、TAE Bufferの使用を推奨します。TBE Bufferを使用した場合、泳動パターンがスメアやスマイリングなどを生じる場合があります。
図1. Guide-it Mutation Detection Kitを用いた変異検出
図2. Guide-itとSurveyorアッセイの比較
Cas9を発現するプラスミド、及びAAVS1 locusに特異的なsgRNAをコードするプラスミドを用いて293T細胞へトランスフェクションし、48時間培養した細胞をトランスフェクションしていない細胞と6段階の比率＊で混合した後、変異検出を行った。Terra PCR Direct Polymerase Mixを用いてターゲットとなるAAVS1 locusを含む領域を増幅し、PCR産物を精製後、Guide-it Resolvase、またはCel1 enzyme（Surveyorアッセイ）で切断し、電気泳動を行った。Guide-itでは変異を容易に検出できたが、Surveyorアッセイでは明らかにスメアーが生じており、切断効率の検出、及び低レベルの変異の検出が困難であった。
* lane 1-6 : 100％, 80％, 60％, 40％, 20％, 0％（トランスフェクションした細胞の割合）
内容
| 100回（製品コード 631443） | 25回（製品コード 631448） | |
| Extraction Buffer 1 | 5 ml×4 | 5 ml |
| Extraction Buffer 2 | 2 ml | 500 μl |
| Guide-it Resolvase | 100 μl | 25 μl |
| Terra PCR Direct Polymerase Mix (1.25 U/µl) | 100 μl | 25 μl |
| 2×Terra PCR Direct Buffer (with Mg2+, dNTP) | 1 ml×3 | 750 μl |
| PCR-Grade Water | 1 ml×5 | 1 ml |
| Positive Control DNA for Resolvase | 75 μl | 75 μl |
保存
－20℃
Application
【ユーザー様実施例】：gRNAの有効性事前確認キット『Guide-it™ Complete sgRNA Screening System』の使用で、変異導入を確かなものに
Technical Notes
Guide-it™ Mutation Detection Kit
CRISPR Cas9によるゲノム編集におけるアデノ随伴ウイルスDNAドナーを用いた高効率ノックイン
Comparison of the Guide-it Mutation Detection Kit with a CEL nuclease-based assay
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