CRISPR/Cas9 プラスミド システム

Guide-it CRISPR/Cas9 Systemは、CRISPR/Cas9ゲノム編集に使用するsingle guide RNA (sgRNA)配列をプラスミドベクターにクローニングし、哺乳類細胞で発現させるためのキットである。本製品に含まれるpGuide-itプラスミドベクターには、Cas9ヌクレアーゼ、蛍光タンパク質（ZsGreen1、またはtdTomato）が搭載されており、クローニングしたsgRNAと同時に、Cas9ヌクレアーゼ、蛍光タンパク質を発現させることができる。蛍光マーカーとして、輝度の高いZsGreen1、tdTomatoを利用しているため、トランスフェクション効率のモニタリングやフローサイトメトリーによる導入細胞の濃縮、単離に用いることができる。sgRNA発現プラスミドの構築は非常にシンプルで、準備するのはターゲット配列に対応して設計した1組のオリゴDNAだけである。製品には線状化済みのベクター、高効率のLigation mix、高効率のStellar Competent Cellが含まれており、準備したオリゴDNAをアニーリング後、簡単に効率良くベクターにライゲーションし、形質転換することができる。
本製品には、10回のsgRNA発現プラスミド構築に必要な試薬が全て含まれている。

図1 pGuide-itプラスミドベクターの構造


図2 pGuide-it-ZsGreen1 plasmidを用いたゲノム編集
12-wellプレートにHEK293細胞、HeLa細胞、U2OS細胞、HT1080細胞、各1×10⁵ cellsを播種し16時間培養した後、Xfect Transfection Reagentを用いてpGuide-it-ZsGreen1 plasmidのトランスフェクションを行った。pGuide-it-ZsGreen1 plasmidは、CCR5、C4BPB、EMX1を標的遺伝子とするsgRNAをそれぞれpGuide-it-ZsGreen1 Vectorにクローニングして作製し、各2.5 μgを用いた。トランスフェクションから48時間後、ZsGreen1の蛍光を蛍光顕微鏡で確認し（A）、FACSでトランスフェクション効率を測定した（B, Transfection efficiency）。ゲノムDNAへの変異導入効率は、PCRベースの変異検出キットであるGuide-it Mutation Detection Kit（製品コード 631443）を用いて調べた（B）。ターゲット配列を含む領域を細胞から直接PCR増幅し、増幅産物を変性、再アニーリングさせてミスマッチを含む二本鎖DNAを作製し、Guide-it Resolvaseでミスマッチ部分を切断した。その後、アガロースゲル電気泳動を行い、デンシトメーターで変異導入の割合を調べた（B, Indel）。

Stellar Competent Cells ：－70℃
その他：－20℃