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Step1 | 細胞ライセートから直接ターゲットサイトを含むゲノムDNA配列(500~700 bp)を増幅する。増幅産物には個々の細胞のゲノム編集部位がプールされる。(注:増幅にはIn-Fusionクローニング用に各15塩基を付加したプライマーを使用) |
Step2 | In-Fusion Snap Assembly Master Mixを用いてpre-linearized pUC19ベクターにPCR産物を直接クローニングする。 |
Step3 | 形質転換後、コロニーPCRによりプラスミドのインサート部分を増幅する。 |
Step4 | DNAシーケンス解析を行い、ターゲットゲノムサイト上に生じた個々の挿入、欠失の配列を確認する。 |
Terra PCR Direct Polymerase Mix | 110 μl |
2X Terra PCR Direct Buffer (with Mg2+, dNTP) | 1 ml×3 |
Extraction Buffer 1 | 400 μl |
Extraction Buffer 2 | 40 μl |
pUC19 Cloning Vector, linearized (50 ng/μl) | 10 μl |
Colony PCR Forward Primer (15 μM) | 200 μl |
Colony PCR Reverse Primer (15 μM) | 200 μl |
PCR-Grade Water | 1 ml×6 |
Guide-it Indel Identification | -20℃ |
In-Fusion Snap Assembly Master Mix | -20℃ |
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | 室温 |
Stellar Competent Cells Stellar Competent Cells :-70℃ その他のコンポーネント:-20℃ |
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