リアルタイムPCRを効率的に行うには、反応性の良いプライマーを設計することが重要です。以下のガイドラインに沿って、増幅効率がよく、非特異的反応が起こらないプライマーを設計してください。
増幅産物
| 増幅サイズ | 80～150 bpが最適 (300 bpまでは増幅可能) |
|---|
プライマー
| 長さ | 17～25 mer |
|---|---|
| GC含量 | 40～60％（望ましくは、45～55％） |
| Tm | Forward primerとReverse primerのTm値が大きく異ならないこと Tm値の計算は、専用のソフトウェアで行う OLIGO＊1 : 63～68℃ Primer3 : 60～65℃ |
| 配列 | 全体的に塩基の偏りがない配列にする 部分的にGCリッチあるいはATリッチな配列は避ける（特に3’末端） T／Cの連続（polypyrimidine）は避ける A／Gの連続（polypurine）は避ける |
| 3'末端配列 | 3'末端がGCリッチあるいはATリッチな配列は避ける 3'末端塩基は、GまたはCが望ましい 3'末端塩基がTであるプライマーは避けたほうがよい |
| 相補性 | プライマー内部およびプライマー間での3 base以上の相補的配列を避ける プライマー3'末端が2 base以上相補する配列を避ける |
| 特異性 | BLAST検索でプラマ－の特異性を確認する＊2 |
*2 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
設計位置
| Genomic DNAとの区別 | エキソンジャンクションに設計する。 | Genomic DNAを検出しないように、エキソンジャンクションを挟む位置に設計する。 |
|---|
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