リアルタイムPCRのプライマー設計について

リアルタイムPCRで高感度に検出するには、特異的に反応するプライマーを設計することが重要である。以下のガイドラインに沿って設計してください。

増幅産物

増幅サイズ100-150 bpが最適300 bp程度までなら増幅可能
Tm90℃以下高すぎると反応効率が低下する

プライマー

長さ17-25 mer
GC含量40-60%
Tm55-65℃
Forward-primerとReverse-primerのTm値が大きく異ならないこと
配列3'末端にGまたはCが3個以上連続する配列は避ける。アニーリングの特異性が低く、プライマーダイマーなど、非特異的産物を生じやすい。
3'末端がTになる配列は避ける。ミスマッチでもアニールすることがある。特異性が低い。
相補性プライマー内部に3'末端と一致する配列 (2ベース以上)が含まれるものは避ける。プライマーダイマーが生じやすい。
特異性BLASTサーチを行い、プライマーの特異性を確認する。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/

設計位置 (リアルタイムRT-PCRの場合)

Genomic DNAとの区別 エキソンジャンクションに設計する。 Genomic DNAを検出しないように、エキソンジャンクションを挟む位置に設計する。
mRNA上での位置 逆転写反応にOligo dT Primerを使用する場合には、mRNAの3'末端からできるだけ近い位置に設計する。

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